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Amplificacion de secuencias ALU mediante PCR - Coggle Diagram
Amplificacion de secuencias ALU mediante PCR
PREPARACIÓN DE TUBOS CON ADN
• Etiquetar tubos de PCR (0.2 mL) con número de muestra.
• Agregar 4 µL de ADN al fondo de cada tubo.
• Preparar Control Negativo: 4 µL de H2O en vez de AD
PREPARACIÓN DE MASTER MIX
(En tubo de 0.5 mL)
•Mezclar por reacción: Amortiguador 10X (1.5 µL), dNTPs (0.3 µL), MgCl2 (0.6 µL), Primer F (0.525 µL) Primer R (0.525 µL), Taq Pol (0.15 µL) y H2O (7.4 )
• Homogeneizar en microcentrífuga (10,000 rpm / 10 s)
ENSAMBLE DE REACCIÓN
• Distribuir 11 µL de Master Mix en cada tubo con ADN.
• Cerrar, mezclar y dar pulso de centrífuga (10,000 rpm)
AMPLIFICACIÓN EN TERMOCICLADOR (PCR)
Desnaturalización inicial: 95 °C por 3 min.
┌──► Desnaturalización: 95 °C por 45 s
| Alineación: 67 °C por 45 s (Repetir 35
└── Extensión: 72 °C por 1 min ciclos)
•Extensión final: 72 °C por 5 min.
•Conservación: 4 °C (∞)
PREPARACIÓN Y CARGA EN GEL DE AGAROSA (1.5%)
• Añadir 2 µL de jugo azul (con GelRed) a cada tubo PCR.
•Mezclar y dar pulso de centrífuga.
• Cargar en carriles del gel (anotar orden izq -> der):
-Marcador de peso (100 pb): 2 µL
-Muestras y Control Negativo: 3 - 10 µL
ELECTROFORESIS Y VISUALIZACIÓN
• Correr gel a 100 V durante 60 - 90 min (hasta que el azul de bromofenol migre al menos 40 mm)
• Apagar fuente, retirar gel y llevar a transiluminador.
• Tomar fotografía