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ESTRAZIONE DELLE PROTEINE - Coggle Diagram
ESTRAZIONE DELLE PROTEINE
La purificazione di una proteina consiste nell'isolarla allo stato puro dall'estratto cellulare grezzo, eliminando tutte le altre macromolecole e conservandone intatta la struttura tridimensionale nativa e l'attività catalitica. Per ridurre al minimo i rischi di denaturazione o degradazione durante l'estrazione, si seguono 3 regole fondamentali:
Tutte le operazioni vengono condotte costantemente a 4C° per rallentare l'attività delle proteasi endogene e prevenire la denaturazione termica
Il protocollo deve ridurre al minimo il numero di passaggi operativi, poiché lavorazioni troppo prolungate aumentano il decadimento dell'enzima
Ogni fase dell'estrazione viene monitorata determinando la quantità di proteine totali e l'attività enzimatica per valutare l'incremento dell'attività specifica
Durante la lisi cellulare, la proteina viene improvvisamente estratta dal suo microambiente naturale ed esposta ad agenti denaturanti, variazione di pH ed enzimi idrolitici. Il tampone di estrazione deve essere accuratamente formulato con specifici additivi:
Molecole con gruppi tiolici liberi, come il ditiotreitolo o il beta-mercaptoetanolo, mantengono ridotti i gruppi -SH della cisteina ed evitano la formazione accidentali di ponti disolfuro errati in presenza di ossigeno.
L'addizione di azide sodica inibisce eventuali contaminazioni batteriche durante le manipolazioni
Miscele di inibitori specifici bloccano l'azione delle proteasi lisosomiali e vacuolari liberate con la lisi
L'aggiunta di sali neutri come NaCl evita l'aggregazione aspecifica, mentre composti osmoregolatori come saccarosio o glicerolo stabiliscono la conformazione ed evitano shock idrodinamici.
Mantenere il pH stabile nell'intervallo fisiologico usando tamponi come tris-HCl o fosfato per preservare lo stato di ionizzazione dei residui
La rottura della membrana plasmatica o della parete cellulare costituisce la prima tappa per accedere al pool proteico citosolico o compartimentale. La scelta del metodo dipende dalla resistenza della parete molecolare del campione:
Shock osmotico: L'immersione in soluzioni fortemente ipotoniche richiama l'acqua all'interno della cellula per osmosi; l'aumento della pressione idrostatica causa il rigonfiamento e la lisi osmotica. E' ideale per cellule animali ed eritrociti privi di parete rigida.
Cicli di congelamento e scongelamento: L'alternanza tra congelamento rapido e scongelamento genera microcristalli di ghiaccio che perforano meccanicamente il doppio strato lipidico
Solubilizzazione chimica e detergenti: l'uso di detergenti come SDS o agenti caotropici come urea disgrega i lipidi di membrana formando micelle miste o indebolendo le interazioni idrofobiche.
Sonicazione: Una sonda ad alta frequenza genera il fenomeno fisico della cavitazione acustica: la formazione e il violento collasso di microbolle gassose producono onde d'urto e forze di taglio idrodinamiche che frantumano pareti e membrane
Pressa di French: La sospensione cellulare viene sottoposta ad altissime pressioni idrauliche e fatta passare attraverso una valvola a calibro microscopico. Il repentino crollo di presione all'uscita disgrega istantaneamente anche le pareti batteriche più resistenti
Digestione enzimatica della parete: metodo biochimico ad alta selettività. Il lisozima idrolizza legami beta(1-4) del peptidoglicano nei batteri specialmente gram+; la liticasi o zimolasi scinde i polisaccaridi strutturali della parete dei lieviti
Omogenizzatori meccanici: Dispositivi a pale rotanti ad alta velocità adatti a sminuzzare e triturare masse muscolari o tessuti vegetali fibrosi
Dopo la lisi si ottiene l'estratto grezzo, una miscela eterogenea di proteine, acidi nucleici e detriti. La prima separazione grossolana si ottiene modulando la solubilità delle proteine mediante l'aggiunta di sali neutri, tipicamente il solfato di ammonio.
Salting in: A piccolissime concentrazioni di sale, gli ioni disciolti schermano le cariche elettriche nette sulla superficie delle proteine, riducendo l'attrazione elettrostatica aspecifica soluto-soluto e aumentandone la solubilità
Salting out: Aumentando la forza ionica, gli ioni del sale sottraggono le molecole d'acqua del guscio di solvatazione della serie liotropica di proteina per idratare se stessi. Private dello strato d'acqua protettivo, le regioni idrofobiche esposte delle proteine s aggregano tra loro per minimizzare il contatto con il solvente polare, determinando una precipitazione reversibile ppriva di denaturazione
La separazione fisica tra la fase solida e la fase liquida si ottiene applicando accelerazioni centrifughe crescenti:
Bassa velocità: Sedimentano le componenti più dense e grossolane: cellule non lisate, nuclei intatti e frammenti di membrana plasmatica.
Media velocità: sedimentano gli organelli cellulari di medie dimensioni: mitocondri, lisosomi e perossisomi
Alta velocità: precipitano le vescicole membranose del reticolo endoplasmatico detti microsomi
Ultracentrifugazione: sedimentano complessi sopramolecolari più leggeri, come i ribosomi.
Il surnatante solubile finale contiene il pool purificato delle proteine solubili citosoliche, pronte per la cromatografia su colonna
L'efficacia di ciascun passaggio di estrazione viene registrata all'interno della tabella di purificazione che raccoglie i seguenti parametri analitici:
Proteine totali (mg): CxV rappresenta la massa di tutte le proteine presenti nel campione. Diminuisce drasticamente segnalando l'eliminazione dei contaminanti
Attività volumetrica (U/mL): unità enzimatiche per mL
Attività enzimatica totale (U): Attività volumetrica x V. Una U è la quantità di enzima che trasforma 1 umol di substrato al minuto. Misura la frazione attiva della proteina. Diminuisce leggermente
Attività specifica AS (U/mg): Attività totale x Proteine totali. Esprime il rapporto tra la proteina d'interesse e le proteine totali presenti. Aumenta significativamente poiché corrisponde all'indice diretto di purezza
Concentrazione proteica C (mg/mL): quantità di proteine per unità di volume, misurata in genere tramite saggi spettrofotometrici. Cala progressivamente
Resa (%): (Attività enzimatica totale dello step/Attività totale iniziale)x100. Percentuale di proteina d'interesse recuperata rispetto all'inizio. Rimanere il più alta possibile
Volume totale V (mL): volume complessivo della soluzione in quella determinata fase. Diminuisce ad ogni step
Fattore di purificazione (adimensionale): AS dello step/ AS dell'estratto grezzo. Indica di quante volte è aumentata la concentrazione della proteina d'interesse rispetto alle altre. Aumentare ad ogni passaggio
Nel corso dei passaggi purificativi, la massa di proteine estranee rimosse decresce molto più velocemente rispetto all'eventuale perdita di unità enzimatiche. Di conseguenza, l'attività specifica aumenta progressivamente. Quando un ulteriore passaggio non produce più alcun incremento dell'attività specifica, si è raggiunto il plateau di purezza, che conferma l'isolamento della proteina allo stato omogeneo