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SEQUENZIAMENTO E TEST MOLECOLARI - Coggle Diagram
SEQUENZIAMENTO E TEST MOLECOLARI
DEFINIZIONE E METODICHE STORICHE VS MODERNE
Test molecolare per risalire alla struttura primaria del DNA
Metodo Sanger: Metodo obsoleto basato sulla terminazione di catena con 4 provette parallele e nucleotidi modificati/marcati; lento e adatto solo per brevi sequenze a causa dell'alta laboriosità
NGS (Next Generation Sequencing): Tecnologie moderne di sequenziamento massivo in parallelo di grandi quantità di DNA (anche genoma intero) non purificato, basate su separazione spaziale e amplificazione locale
Gestione dei big data: Ruolo cruciale di data scientists e bioinformatici per allineamento, variant calling e annotazione
PRINCIPALI METODICHE NGS NELLA PRATICA CLINICA
Genome Analyzer (Illumina): Basato sulla sintesi (duplicazione e sintesi di una nuova molecola di DNA, simile a Sanger)
Ion Torrent (Thermo Fisher Scientific): Sequenziamento non basato sulla sintesi che sfrutta la variazione di pH ($\Delta\text{pH} \approx 0.02$ per ogni nucleotide incorporato) rilevata da un chip elettronico
PROGRAMMI DI SEQUENZIAMENTO ATTUALI
Target Sequencing (Sequenziamento Mirato): Il più usato; analizza 1 o pochi geni tramite pannelli predefiniti (es. fibrosi cistica, cardiopatie ereditarie, sindrome di Marfan, oncologia)
WES (Whole Exome Sequencing): Sequenziamento dell'intero esoma (tutti i geni tradotti in proteine)
WGS (Whole Genome Sequencing): Sequenziamento dell'intero genoma (~21.000 geni), attualmente limitato nella resa dall'effettiva conoscenza patogenetica di circa 4500-5000 geni
Resa diagnostica: Circa $42\%$ per WGS e $20\%$ per WES
COVERAGE E IDENTIFICAZIONE DEGLI ASSETTI ZIGOTICI
Coverage: Numero medio di letture della regione target per abbattere il tasso di errore (es. $80\text{-}100\text{X}$ nel WES; basso nel Sanger)
Omozigosi: Variante rilevata in circa il $100\%$ delle letture
Eterozigosi: Variante rilevata in circa il $50\%$ delle letture
Mosaicismo: Variante rilevata in percentuali diverse dal $50\%$ e $100\%$ in base alla quota di cellule mutate nel campione
APPLICAZIONI E INDICAZIONI PEDIATRICHE
Diagnosi di patologie monogeniche e valutazione del rischio riproduttivo (portatori sani di mutazioni recessive)
Valutazione della predisposizione a patologie e farmaco-sensibilità tumorale
Indicazioni pediatriche per WES/WGS: Disordini del neuro-sviluppo, alterazioni comportamentali, malformazioni multiple, disordini della crescita (es. macrocefalia)
VARIANT CALLING E FILTRAZIONE DEI DATI
Processo computazionale per confrontare le varianti del paziente con librerie di riferimento e isolare quelle potenzialmente patologiche tra migliaia di output
Metodi di scrematura:
Concordanza fenotipo-varianti: Uso dell'Human Phenotype Ontology (HPO) per escludere geni non correlati al quadro clinico
Analisi di segregazione familiare (genitori): Esclusione di varianti già presenti in entrambi i genitori sani (mutazioni non patogenetiche), tenendo conto della modalità di trasmissione (es. test genetico sui genitori noto in alcuni contesti come analisi de CRINOX, utile a ridurre le varianti a 10-20 candidati)
RISULTATI INCIDENTALI E CONSENSO INFORMATIVO
Possibilità di identificare varianti non correlate al quesito iniziale (es. predisposizione all'Alzheimer, geni BRCA-1/2, sindrome di Lynch)
Raccolta del consenso informato preventivo: il paziente sceglie se essere informato solo sul quesito diagnostico o anche sui riscontri incidentali (con obbligo di comunicazione per quelli utili alla prevenzione o terapia precoce)
FOCUS: CLASSIFICAZIONE DELLE VARIANTI GENICHE E IMPLICAZIONI CLINICHE
Varianti causative/patogenetiche: Causano direttamente la malattia (secondo penetranza ed espressività) e giustificano l'inizio di una terapia
Varianti predisponenti: Aumentano la probabilità di sviluppare patologie multifattoriali in interazione con fattori ambientali; utili per indirizzare la prevenzione mirata
Varianti di significato incerto (VUS): Significato clinico non definito per mancanza di dati in letteratura, mutazioni in domini ininfluenti o variazioni missenso neutre
Varianti non-patogenetiche: Variazioni di sequenza note e non associate a malattia, presenti in $\ge 1\%$ della popolazione