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METODICHE E TEST CITOGENETICI E MOLECOLARI - Coggle Diagram
METODICHE E TEST CITOGENETICI E MOLECOLARI
CARIOTIPO
Test citogenetico "grossolano" per studiare numero e struttura dei cromosomi
Indicazioni diagnostiche: Aneuploidie cromosomiche (es. trisomie) e riarrangiamenti macroscopici superiori a $4\text{ Mb}$ (soglia di rilevabilità)
Procedura: Prelievo di cellule (es. sangue con eparina), coltura e blocco in metafase (cromosomi spiralizzati), osservazione al microscopio ottico con colorazione Giemsa
Morfologia cromosomica: Autosomi ordinati per grandezza più cromosomi sessuali; distinzione in braccio lungo ($q$) e braccio corto ($p$, in alto), suddivisi in regioni, bande e sotto-bande
Bandeggiatura dei cromosomi: Riflette la composizione in basi (GC o AT) e la ricchezza genica
Bandeggiatura G (Giemsa): Bande nere (ricche in AT, povertà di geni, maggiore affinità) e bande bianche (ricche in GC, ricchezza di geni, minore affinità)
Bandeggiatura Q (Quinacrina): Fluorocromo che evidenzia fluorescenza maggiore o minore (equivalente alla banda G)
Risoluzione: Limitata dalla spiralizzazione metafasica (limite minimo di $4\text{-}8\text{ Mb}$, invisibili le mutazioni puntiformi)
FISH (FLORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION)
Tecnica citogenetica per rilevare e localizzare sequenze di DNA note di lunghezza superiore a $4\text{ Kb}$ (oggi ampiamente sostituita dalla MLPA)
Utile per indagare traslocazioni, riarrangiamenti, delezioni e duplicazioni
Procedura: Estrazione dei frammenti e fissaggio su vetrino, creazione di una sonda a DNA/RNA marcata con biotina complementare al bersaglio, ibridazione, lavaggio e aggiunta di avidina-fluorocromo per la visualizzazione al microscopio a fluorescenza
MLPA (AMPLIFICAZIONE LEGATURA-DIPENDENTE MULTIPLA DELLA SONDA)
Metodo semi-quantitativo per rilevare il numero di copie di una sequenza nota di DNA tramite due sonde regione-specifiche adiacenti
Procedura: Denaturazione, ibridazione delle sonde, ligazione per formare un unico elemento, amplificazione ed elettroforesi capillare con marcatura fluorescente
Interpretazione: Conversione in grafico a picchi; l'altezza o l'area del picco rapportata a un controllo noto permette di valutare la dose genica
CGH-ARRAY (COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION ARRAY)
Analisi comparativa ad ampio spettro del genoma per riconoscere sbilanciamenti genici (delezioni o duplicazioni) dell'ordine di qualche kb (non rileva mutazioni puntiformi o riarrangiamenti bilanciati)
Procedura: Co-ibridazione in pozzetti di DNA del paziente e DNA controllo marcati diversamente su sonde fissate
Segnali di lettura:
Segnale paziente > controllo: Eccesso del segmento d'interesse nel paziente (duplicazione/guadagno)
Segnale paziente = controllo: Stessa dose genica
Segnale paziente < controllo: Deficit o assenza del segmento nel paziente (delezione/perdita)
SNP-ARRAY
Metodologia avanzata basata sulla caratterizzazione di tutti gli SNP del genoma tramite sonde specifiche (ha largamente sostituito il CGH-array)
Applicazioni principali:
Rilevamento di sbilanciamenti genici (delezioni/duplicazioni) grazie a una densità di uno SNP ogni circa $290\text{ pb}$
Diagnosi di disomie uniparentali (UPD) e test di paternità (tracciando l'origine materna o paterna degli alleli)
Individuazione di mosaicismi (differenze marcate di SNP tra genomi di cellule diverse)
Nota metodologica: CGH-array e SNP-array rilevano polimorfismi e varianti strutturali, non mutazioni puntiformi (frequenza $< 1\%$)