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METODI DI BIOLOGIA MOLECOLARE E DI INGEGNERIA GENETICA - Coggle Diagram
METODI DI BIOLOGIA MOLECOLARE E DI INGEGNERIA GENETICA
NUCLEASI
FOSFATASI
CLASSIFICAZIONE NUCLEASI E SPECIFICITà
ENZIMI DI RESTRIZIONE
TRE TIPI DI ENZIMI DI RESTRIZIONE
SITO DI TAGLIO ENZIMI DI RESTRIZIONE TIPO II
TAGLI SFALSATI E TAGLI PIATTI
molecola di DNA dopo essere stata tagliata da enzimi di restrizione --->
si hanno FRAMMENTI DI DNA CARICHI NEGATIVAMENTE
che possono essere separato tramite
ELETTROFORESI IN GEL
sulla base delle loro dimensioni
CLONAGGIO
caratteristiche dei VETTORI
VETTORI DI CLONAGGIO POSSONO ESSERE PROGETTATI PER UTILIZZI DIVERSI
DIVERSI VETTORI
FAGO
COSMIDI
YAC
PLASMIDI
BAC
VETTORI SHUTLE
VETTORI DI ESPRESSIONE
GENE REPORTER
LUCIFERASI
lacZ
GFP
DETTAGLI E VARIABILI CHE INFLUENZANO IL PROCESSO
ESEMPIO - VETTORE PER SELEZIONE BLU/BIANCO (vettore plasmidico di clonaggio)
ESPERIMENTO DI CLONAGGIO
E. coli utilizzato
come forzare il DNA a entrare nella cellula? esistono due metodi
---> entrambi creano pori nella parete cellulare:
scopo del vettore sopra --->
amplificazione dell'inserto di DNA
(dimensione fino a 10 kb) - solo amplificazione senza esprimere l'inserto (produrre proteina)
COME RILEVARE GLI ACIDI NUCLEICI?
COME RILEVARE ACIDI NUCLEICI CON SEQUENZE SPECIFICHE/PRECISA?
- SONDA
specifiche reazione
Sequenza bersaglio può essere
DNA = SOUTHERN BLOTTING
oppure
RNA = NORTHERN BLOTTING
ESEMPIO CON SOUTHERN BLOT
5. TIPI DI MARCATURA DELLA SONDA
5. IBRIDAZIONE AVVIENE IN UN TAMPONE
6. LAVAGGIO - STRINGENZA
7. AUTORADIOGRAFIA
IBRIDAZIONE IN SITU
ALTERNATIVE NON RADIOATTIVE ALLA MARCATURA DELLA SONDA
4. TECNICHE DI SEPARAZIONE DEL DNA
METODI ROTTURA MOLECOLA PIù GRANDE
ELETTROFORESI IN GEL