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Diagnostica Sierologica ed ELISA - Coggle Diagram
Diagnostica Sierologica ed ELISA
Diagnostica Sierologica
cerca risposta immunitaria dell'ospite (anticorpi)
IgM (primi anticorpi prodotti)
indica infezione acuta /recente
4-5 giorni
IgG
infezione cronica
siero convalescente
più tardive
memoria immunitaria
interpretazione
IgM^+ / IgG^- = Infezione molto recente.
IgM^+ / IgG^+ = Infezione in fase sub-acuta
IgM^- / IgG^+ = Infezione superata (memoria immunologica)
Limiti
Finestra sierologica
tempo necessario all'ospite per produrre anticorpi rilevabili dopo l'infezione
scopo
ricerca anticorpi (Ab)
vengono prodotti dall'ospite per
Contatto con l'antigene
contatto con antigene (Ag)
può essere costituito da
Intero microrganismo o antigeni estratti
test indiretti
cerca e quantifica gli
Anticorpi nel siero
nella fase acuta (iniziale) può dare
Falsi negativi (Ab assenti o molto bassi)
Periodo finestra (l'infezione c'è ma l'ospite non ha ancora prodotto anticorpi)
richiede invece l'uso di test
Diretti (es. PCR o ricerca antigeni)
Falsi Positivi
Cross-reattività (anticorpi che si legano a patogeni simili)
reazioni sierologiche
sfruttano l'unione in vitro tra
Antigene-Anticorpo
Per una corretta diagnosi sierologica si preleva il
Doppio Siero
comprende il
Siero Convalescente
prelevato a distanza di
2-3 settimane
Siero Acuto
prelevato immediatamente alla
Comparsa dei sintomi
REAZIONI SIEROLOGICHE
Precipitazione
Ag solubile
Linea di precipitazione
AGID
Test di Coggins
Fenomeno paradosso
Agglutinazione
Ag corpuscolato
Reticolo
Ring Test
Coombs
Emoagglutinazione
Reticolo = positivo
Bottone = negativo
Inibizione Emoagglutinazione
Virus emoagglutinanti
Anticorpi bloccano virus
Bottone = positivo
Reticolo = negativo
Titolo inibente
Test ELISA
risultati colorimetrici
positivo: presenza enzima/colore
negativo: lavaggio anticorpi/no colore
sfrutta
reazioni enzimatica
per misurare
titolazione anticorpale
Il principio fondamentale si basa sull'
Adsorbimento
fissa sul fondo del pozzetto gli
Antigeni specifici noti
Fasi sequenziali (ELISA Indiretto)
1.Fissazione Ag sul fondo
fase successiva: aggiunta del
Siero del campione in esame
2.Aggiunta del siero
se sono presenti, gli anticorpi effettuano il
Legame specifico con l'antigene
3.Legame specifico Ag-Ab
fase fondamentale obbligatoria:
Incubazione
Lavaggio
serve a rimuovere gli
Anticorpi non legati (evita falsi positivi)
4.Dopo il lavaggio
si immette nel pozzetto l'
Anticorpi anti-specie (secondario)
è legato chimicamente ad un enzima, detto
Coniugato
5.Aggiunta del coniugato
fase successiva: secondo
Incubazione e Lavaggio
6.Dopo il secondo lavaggio
si inserisce il
Substrato specifico dell'enzima
Se l’enzima è presente, il substrato subisce una reazione chimica e cambia colore.
prelievo sangue (può essere anche saliva,urina,latte)
Separazione Siero
Sviluppo e lettura del risultato:
Substrato + Enzima
reagiscono determinando una
Variazione cromatica (il pozzetto si colora)
Reazione enzimatica
viene bloccata inserendo la
Stop solution
La quantificazione e lettura
avviene tramite valutazione
Spettrofotometrica
IMMUNOFLUORESCENZA
Diretta ➡ Antigene
Indiretta ➡ Anticorpi
Intensità del colore
risulta direttamente
Proporzionale alla quantità di anticorpi
TEST ELISA
può essere strutturato come
ELISA Competitivo (es. test ufficiale WOAH per Blue Tongue)
Evoluzione tecnologica rapida
porta ai
Test immunocromatografici a flusso laterale
utilizzato per diagnosi
1 more item...
ELISA DIVA (Vaccino marker)
Vaccinati
≠
Infetti
Ricerca IgE
Rinotracheite Infettiva Bovina
La quantificazione degli anticorpi determina il
Titolo Anticorpale
è definito come la
Più alta diluizione di siero positiva
La classificazione delle reazioni dipende dallo
Stato fisico dell'antigene
Ag = Su superficie corpuscolata
determina reazioni di
Agglutinazione
comprende i test:
su vetrino, In provetta, e Ring Test (es. Brucellosi nel latte)
Ag = Proteina solubile
determina reazioni di
Precipitazione
esempi di applicazione:
in provetta e AGID (Immunodiffusione in gel di agar)
Ag = Riduzione capacità infettante virus
determina la
Sieroneutralizzazione
è un test ad
Alta sensibilità e specificità
Diagnostica DIRETTA (Ricerca Ag / DNA)
➡ PCR
➡ Immunofluorescenza diretta
➡ ELISA diretto
Diagnostica INDIRETTA (Ricerca Anticorpi)
➡ ELISA indiretto
➡ AGID
➡ Agglutinazione
➡ Emoagglutinazione
➡ Sieroneutralizzazione