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PCR (Reazione a Catena della Polimerasi) - Coggle Diagram
PCR (Reazione a Catena della Polimerasi)
IL CICLO (Nel Termociclatore)
Fase 1: DENATURAZIONE
95°C
separazione filamenti
Processo cinetico ripetuto per 25-40 cicli
AMPLIFICAZIONE esponenziale
2^n copie
Fase 2: ANNEALING (Appaiamento)
55°C (Range: 50-65°C)
legame dei primer
Fase 3: ESTENSIONE (Allungamento)
72°C
estensione tramite Taq
2 copie di dsDNA
ripetizione x 25-40
MILIONI DI COPIE (2^n)
LIMITI TECNICI
Contaminazioni ("Carry-over")
falsi positivi causa di aerosol di PCR precedenti
Vitalità cellulare
Non distingue tra patogeno vivo/infettivo e residui di DNA di un patogeno già morto/neutralizzato
La Natura (Cos'è chimicamente)
Sintesi enzimatica
perché usa la Taq polimerasi
In vitro
che permette Amplificazione acellulare
senza batteri o colture vive
e Cinetica esponenziale (il DNA raddoppia a ogni ciclo: 2^n)
Il Target (Cosa copia)
DNA stampo
il punto di partenza
Frammento target / specifico di DNA
non copia tutto il DNA, ma solo un pezzo
Amplicone
prodotto finale, cioè il miliardo di copie ottenute
Scopo Clinico (A cosa serve)
Diagnosi diretta
ricerca il genoma (DNA,RNA) del patogeno, no anticorpi
Fase acuta
identifica l'infezione attiva, fin da subito
(anche asintomatici)
Elevata
sensibilità e specificità
Velocità (poche ore) + Economicità
protocollo operativo
1.estrazione e purificazione
campioni: sangue, latte, feci, biopsie
controllo qualità e integrità
2.scelta e sintesi primers
3.Assemblaggio mix di reazione
DNA stampo (quaderno da copiare*)
Taq polimerasi (enzima copiatore*)
Da Thermus aquaticus
TERMOSTABILITÀ
direzione esclusiva 5' ──> 3'
Primers (indicazione di partenza)
Forward
5' ──> 3'
Reverse
3' ──> 5'
Nucleotidi
precursori affinché la DNA polimerasi possa costruire il nuovo filamento complementare
A – T (Adenina – Timina)
C – G (Citosina – Guanina)
Rapporto equimolare --> substrato energetico e strutturale
cloruro di magenesio (MgCl2)
Fondamentale per l'attività dell'enzima della Taq
COFATTORE
buffer a ph alcalino controllato
4.reazione di PCR (cicli)
5.elettroforesi su Gel
6.purificazione e sequenziamento
Campione Clinico (Tampone)
Lisi cellulare
Estrazione/Purificazione DNA
Mix di reazione (Taq, Primer, dNTPs, Mg²⁺)
Termociclatore (Denat/Anneal/Estens)
Amplificazione Esponenziale (2^n)
Visualizzazione Risultato via Elettroforesi su Gel di Agarosio (Migrazione verso il polo positivo + Marker (calibrazione grandezza) visualizzazione raggi UV e fluorescenza)
Rilevazione Fluorescenza
Interpretazione: Presenza della Banda Fluorescente al corretto peso molecolare (bp) = TEST POSITIVO
evoluzione tecnica
PCR base (fondamentale)
Real-time PCR (moderna e automatizzata)