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metodo - Coggle Diagram
metodo
CROMATOGRAFIA (x purificare qualcosa)
colonna
GF
eluizione isocratica, no adsorbimento
principio meccanico: raggio idrodinamico, PM e forma analita
più grande l'analita prima esce
cut off
effetto forma
se PM= eluiscono prima con r maggiore
effetto di stato conformazionale
p nativa è + compatta, denaturata è estesa quindi eluisce prima
stima
del PM degli analiti se native, tempo di eluizione e fattore di ritenzione
stima stato e tipo di folding (+ grande r + sub ha) se so il PM
interazioni p-cofattore
x sostituzione del solvente
a scambio ionico
interazioni eletttrostatiche
scambiatore
metodi
aumento la costante dielettrica del mezzo (+ polare, + deboli le interazioni elettrostatiche) e aumentare la forza ionica aggiungendo un sale
variare il pH, modificando così le cariche delle proteine
per interazioni idrofobiche
sì adsorbimento, eluizione iso o gradiente
sfrutta l'effetto idrofobico: l'esposizione di un gruppo idrofobico all'H2O induce ordine nel solvente
le p native non hanno molti residui esposti (nel folding vanno nel core)quelli idrofilici esposti fanno interazioni con la resina
di affinità
è ad adsorbimento, sfrutta interazioni MOLTO specifiche come p-ligando
per eluire ci sono 2 strategie
aspecifica
condizione drastica/denaturante
specifica
sfrutta la competizione
caratterisitche
fase mobile
fase stazionaria
principi
gravità
pompe
campo centrifughe
pipettaggio
per monitorarla
rilevatore
cromatogramma
flow through
tempo/volume di ritenzione
k, fattore di ritenzione=Cr-tm/tm
risoluzioneR=(t2-t1/w1+w2)/2
piatti teorici=N=(L/σ)^2
coeff di ripartizione= [analits legato alla stazionaria]/[composto libero all'equilibrio]
PREPARAZIONE ESTRATTO GREZZO
tampone
forza ionica
sali
detergenti
LISARE (primo passo x isolare macrom)
separare con centrifugazione
c normali
ultracentrifughe
protocolli
all'equilibrio
isopicnica
non all'equilibrio
c differenziale
c zonale
c di velocità
elutriazione
chimici
detergenti ionici (SDS)
d non ionici (triton X-100)
solventi organici
POI shock osmotico in ipotonica
enzimatici
lisozima(batteri), zimolasi, (lieviti) chitinasi
meccanici
freeze and thaw
omogeneizzatore
sferette in vetro
french press
sonicatore
SOSTITUZIONE DEL SOLVENTE
dialisi
processo lento, usa membrana sempipermeabile porosa impermeabile a soluti grandi in base al cut off, uso un tampone, i soluti al di sotto del cut off si muovono x diffusione
gf
ultrafiltrazione
liofilizzazione
evaporazione del solvente organico, il campione è prima congelato e poi in centrifuche speed-vac che permettono di lavorare sottovuoto e refrigerando, il solvente sublima e ottengo un residuo secco
SALTING
precipitazione con ammonio solfato
Cromatografia di scambio ionico
aggiunta di sali per controllare la solubilità
basse concentrazioni del sale=salting in
aumento solubilità della proteina
riduzione delle interazioni proteina-proteina per schermatura ionica.
sali caotropici
alte conc=salting out
sale compete con la proteina per le molecole d’acqua.