Please enable JavaScript.

Coggle requires JavaScript to display documents.

TÈCNIQUES IMMUNOLÒGIQUES - Coggle Diagram

- - - - Primari
        
        La reacció entre antigen i anticòs NO es visible directament i calen altres sistemes per fer-ho evident.
      - Secundari
        
        La reacció entre antigen i anticòs primari condueix a una reacció secundària que es caracteritza per l’aparició d’un fenòmen visible. Ex: grup sanguini
    - - Semiquantitatives
        
        Dona una idea de la quantitat que hi ha del que s’analitza, però no dona un valor de quantitat amb unitats mesurables.
        (gens, poc, bastant, molt)
      - Quantitatives
        
        El resultat que s’aconsegueix és un valor que té unitats mesurables (245,23 grams)
      - Qualitatives
        
        El resultat que s’obté és “positiu” o “negatiu”. (n’hi ha, no n’hi ha)
  - - - segons ús al laboratori
        
        Monoclonal
        
        Ac únic
        
        S'uneix a un únic epítop de l'antigen
        
        Són cars de produir
        
        Policlonal
        
        Barreja de diferents anticossos
        
        S'uneix a diferents epítops de l'antigen
        
        Són barats de produir
        
        Obtenció
        
        1. Es fa que un organisme (ratolí) entri en contacte amb un antígen en concret.
        2. S’espera que es produeixi una resposta Immune.
        3.
        
        Obtenim sèrum amb els Ac policlonals (amb Ac per a cada epítop).
        
        Si volem obtenir Ac monoclonals, hem de prendre les cèls plasmàtiques i unir-les amb cèls de mieloma (les hibridem → cèl plasmàtica + cèl mieloma = hibridoma). Després, les separem a través de citometria de flux i les posem a produir.
        
        Les cèls de mieloma permeten obtenir una línia cel·lular immortal
      - segons lloc d'unió
        
        Primari
        
        És aquell que detecta i s’uneix a un antigen concret.
        
        Secundari
        
        És aquell que detecta i s’uneix a un anticòs primari.
        
        Per la producció d’Ac secundari posem Ac del ratolí a un altre animal, que el detecta com a extrany, aquest generarà Ac especifics per l’Ac del ratolí i extraurem sang per obtenir els Ac secundaris.
        
        Exemple: Ag adherit a una placa, volem veure si el pacient té Ac contra l’Ag o no. Ac primari detecta l’Ag de forma específica, l’Ac secundari detecta l’Ac primari i, a través d’una tècnica enzimàtica, fem que emeti llum o color.
- - - - Es basen en la capacitat que tenen els Ag multivalents (tenen varis epítops) per unir-se als seus anticossos complementaris = immunocomplexes visibles a simple vista
        
        Eficient amb IgM i IgG
        
        S'utilitzen Ag particulats (grans) → Reacció + visible
        Ex: bacteris, làtex, eritròcits humans o d'altres espècies (hemaglutinació)
    - - Fora de la zona d’equivalència no s’observa el fenomen d’aglutinació per excés d’anticòs o bé per excés d’antigen.
        
        Ag > Ac → no red (prozona)
        
        Ag = Ac → Aglutinació (zona equivalència)
        
        Ag < Ac → no red (prozona)
    - - DIRECTA
        
        Tipus
        
        Hemaglutinació directa
        
        Test grup sanguini: Es barreja sang (eritròcit = Ag) del pacient amb sèrums anti-A, anti-B i anti-D. La presència o absència d’aglutinació indica quins antígens (A o B) hi ha als eritròcits i permet determinar el grup sanguini.
        
        Prova ràpida d'aglutinació en placa
        
        En aquesta prova s'usa Rosa de Bengala com a colorant per tenyir cèls de brucella (bacteri). S'afegeix el sèrum del pacient i si aglutina vol dir que té anticossos contra el bacteri.
        
        Teoria
        
        L’antigen (bacteri o eritròcit) és particulat i la unió directa amb l’anticòs fa que aglutini.
      - INDIRECTA
        
        Tipus
        
        Hemaglutinació
        
        Tipus segons
        ús dels eritròcits
        
        Hemaglutinació indirecta (HAI)
        
        Eritròcit = Partícula a la qual se li uneixen altres Ag
        
        TÍTOL D'ANTICOSSOS
        
        1 more item...
        
        Inhibició de la hemaglutinació (IHA)
        
        Intro
        
        1 more item...
        
        Procediment
        
        1 more item...
        
        Aglutinació amb làtex
        
        Resultat d’experiments d’aglutinació amb partícules de làtex. Poden ser sobre portaobjecte, tubs d’assaig o kits.
        
        Test de Coombs
        
        Intro
        
        Permet detectar Ac que s'uneixen a eritròcits però que no són capaços de fer-los aglutinar.
        
        S'utilitza un Ac anti-globulina, que és capaç de reconèixer Ac. Aquest s'unirà als Ac que estiguin units als eritròcits i farà que aglutinin.
        
        Tipus
        
        Directe
        
        Per detectar Ac ja units a eritròcits d'un pacient
        
        Diagnòstic de malalties hemolítiques, quan hi ha Ac en la sang atacant els propis eritròcits.
        
        Procediment
        
        1 more item...
        
        Indirecte
        
        Per detectar Ac solubles (lliures al sèrum del pacient) que puguin reconèixer eritròcits.
        
        Comprobar si la sang d'un donant és compatible amb la d'un receptor.
        
        1 more item...
        
        Procediment
        
        1 more item...
        
        segons detecció
        
        Per detectar Ac
        
        L’Ag està adsorbit a la superfície d’una altra partícula i la unió amb l’anticòs fa que aglutinin aquestes partícules.
        
        Per detectar Ag
        
        Partícules recobertes d’un Ac purificat permeten detectar i aglutinar antígens.
        
        Aquesta tècnica és mes sensible ja que permet regular la densitat (Ag o Ac) sobre la superfície de la partícula.
  - - - Tècniques d'IMMUNODIFUSIÓ (passiva)
        
        Tipus
        
        Doble
        
        Simple (mètode de Mancini)
        
        L'Ac està distribuït de manera homogènia en el gel d'agarosa i les mostres amb Ag QUE VOLEM DETECTAR es col·loquen en petits pouets. L'Ag difon radialment pel gel i, quan arriba a la zona d’equivalència amb l'Ac, es forma una línia (anell) de precipitació.
        
        Quantitativa: Diàmetre de circumferència de precipitació és proporcional a la [Ag] que hi ha a la mostra. S’elabora una recta de calibració amb mostres patró d’Ag conegut (diàmetre-concentració). A partir de la seva equació, es poden determinar les [mostres problema] mesurant els diàmetres experimentals.
        
        Intro
        
        La reacció Ag-Ac té lloc en un suport semisòlid: Agarosa o agar
        
        Aquest material, a nivell microscòpic, és porós i té ↑ [aigua] a l'interior.
        
        Permet que hi difonguin les substàncies de manera passiva, espontània i així establir gradients de [Ag i/o Ac] (llocs amb [ ] més elevada i altres amb [ ] més baixa).
        
        Es formen línies/bandes de precipitació en el lloc on hi ha proporció adequada d'Ac i Ag.
  - - - Prova molt complexa que utilitza la capacitat que tenen les proteïnes del complement per:
        
        Unir-se a complexos antigen/anticòs.
        
        Unir-se a anticossos que estan units a cèl·lules i llisar-les.
        
        Detecta Ac en sèrum, quan no es poden detectar per altres tècniques pq no mostren reaccions visibles.
        
        Prova qualitativa
        
        Aplicació: Diagnòstic serològic de Brucelosis, Coccidiomicosis i histoplamosis.
        
        Resultat positiu: NO hemòlisi
        Resultat negatiu: Hemòlisi
    - - Addicionar la quantitat adequada de complement, ja que sinó pot donar falsos negatius.
      - Addicionar la quantitat adequada dels Ag, si no hi ha prou pot donar falsos negatius.
      - S'ha d'escalfar la mostra a 56ºC per destruir la hemolisina i inactivar el complement del sèrum problema.
    - - Escalfar a 56ºC durant 30 min.
        
        Preparar dilucions del sèrum problema inactivat.
        
        Addicionar una quantitat coneguda de sèrum a una quantitat coneguda d'antígen. Si al sèrum hi ha Ac, es formaran immunocomplexes.
        
        Afegir el complement
        
        Si hi ha complexos Ag–Ac → Complement s’hi fixa (es consumeix).
        
        Si NO hi ha complexos → Complement queda lliure.
        
        S’afegeixen eritròcits d’ovella + hemolisina (Ace).
        
        Si el complement està lliure → Produeix hemòlisi.
        
        Si el complement ja s’ha consumit → NO hi ha hemòlisi.
        
        “Si no es trenquen els eritròcits, el pacient SÍ té anticossos.”
- - - - Heterogeni (ELISA)
        
        Intro
        
        És necessari separar l'Ac unit a Ag de l'Ac que no s'ha unit a Ag.
        
        Separació: Unió de l'Ag o l'Ac a un suport sòlid per adsorció. Després, amb rentats (tècnica heterogènia), separem Ac o Ag no units al suport i ens quedem amb el complex Ag-Ac que sí està unit al suport.
        
        No competitiva
        
        Característiques
        
        Suport
        
        Enzims (marcador)
        
        Substrat: Normalment cromogènic
        
        Processos bàsics
        
        Tapisat: És l’absorció dels Ag o Ac, conjugats o no, en el suport.
        
        Rentats: Eliminar la resta de mostra/Ag/Ac que no s’hagin fixat.
        
        Incubar: Unir Ag/Ac/Marcadors
        
        Addicionar el substrat: Afegir el substrat per donar pas a la reacció
        
        Frenar: Parar la reacció del enzim
        
        Lectura de resultats
        
        Tipus
        
        Indirecta
        
        Tapisat d'Ag específics pels Ac QUE ES VOLEN DETECTAR i rentat.
        
        S'afegeix sèrum problema, els Ac reaccionaran amb els Ag fixats al suport. Rentat.
        
        S'afegeixen Ac conjugats amb un enzim que reaccionen amb els Acp que s'han unit als Ag. Rentat
        
        Addició del substrat i lectura colorimètrica del producte.
        
        Si Ac secundari s'uneix a Ac-Ag → Es veu Color
        
        Sandwich (DAS) directa
        
        Ac de captura s'immobilitza a la placa i fixa Ag PRESENT EN LA MOSTRA. S'afegeix un Ac específic marcat amb un enzim que s'uneix a l'Ag. En afegir el substrat, genera un senyal colorimètric.
        
        Directa
        
        Ag DE LA MOSTRA s’immobilitzen (tapisat) sobre una placa i es fa un rentat.
        
        S’hi afegeixen Ac marcats amb un enzim i es fa un rentat.
        
        S’afegeix el substrat i la reacció enzimàtica genera un senyal mesurable proporcional a la quantitat d’antigen.
        
        Si Ag-Ac → Es veu Color
        
        Sandwich (HADAS) indirecta
        
        Ac de captura s'immobilitza a la placa i fixa Ag PRESENT EN LA MOSTRA. S'afegeix un Ac específic que s'uneix a l'Ag. S'afegeix un Ac secundari marcat amb un enzim. En afegir el substrat, genera un senyal colorimètric.
        Ac secundaris són més POTENTS perquè amplifiquen el senyal.
      - Homogeni (EMIT)
        
        Intro
        
        Mesura l’activitat enzimàtica per saber quanta quantitat d’antigen hi ha a la mostra.
        
        Detecta Ag com tòxics o fàrmacs (molèc petites).
        
        Homogeni: No es fan rentats. Tota la tècnica es fa en el mateix medi.
        
        Competitiu
        
        Procediment
        
        Reactius
        
        Mostra que conté o no Ag soluble (volem detectar)
        
        Enzim conjugat a una molèc d'Ag
        
        Ac contra l'Ag d'interès
        
        Substrat de l'enzim (ex: S → substrat cromogènic)
        
        Barrejar la mostra (Ag), l'enzim + Ag i els Ac.
        
        Afegir substrat de l'enzim
        
        Observar presència o absència de producte
        
        Resultat: Per determinar la concentració és pot fer comparant amb el patró (semi-quantitatiu) o bé a través d'espectrofotometria.
        
        Si a la mostra NO hi ha Ag, els Ac s’uneixen a l’Ag que està conjugat amb l’enzim, tapant el lloc d’unió del substrat. Inhibeix la reacció, impedint que es formi producte → NO Color.
        
        Si a la mostra SÍ hi ha Ag, els Ac s’uneixen a l’Ag de la mostra i deixen lliure l'Ag conjugat a l’enzim. Això permet que el substrat s’uneixi a l’enzim → Reacció → Producte que té Color.
  - - - Molècs que actuen com a marcadors de la reacció primària antigen/anticòs.
        
        Aquests marcadors s’han de poder unir a l’Ag o l’Ac de forma complementària, sense alterar unió Ag/Ac.
        
        Han de ser detectables i mesurables
        
        Ex: Enzims, nanopartícules acolorides (metalls pesats), substàncies fluorescents i isòtop radioactius.
        
        CONJUGAR: Unir de manera covalent i estable la molècula que servirà de marcador a un anticòs o un antigen.
    - - Unim a un dels reactius de l’anàlisi una molècula (marcador) que es pugui detectar per mètode:
        
        Fluorescent
        
        Ac conjugat a una molècula fluorescent (fluoròfor).
        
        Fluoròfor: Molèc amb la capacitat d'absorbir llum a una longitud d'ona (λ) determinada i d'emetre una altra llum de λ diferent.
        
        Enzimàtic
        
        Utilitzem enzims que, mitjançant la reacció de substrats concrets, donen lloc a productes que es poden detectar i quantificar:
        
        Fluorescent
        
        Producte: Fluorescent
        
        Detecció: Llum fluorescent
        
        2 more items...
        
        Cromogènic
        
        Producte de la reacció: Color.
        
        Detecció → Espectrofotòmetre.
        Quantifica la quantitat de llum absorbida (absorbància) d’una longitud d’ona concreta, segons el cromògen.
        
        Quimioluminiscent
        
        Producte reacció de HRP amb luminol: Llum.
        
        Detecció → Film fotogràfic o amb una càmera d’alta sensibilitat (donen una imatge).
        
        També es pot utilitzar un detector i dona com a resultat un valor d’unitats de llum.
        
        Ac conjugat a un enzim concret. Els més utilitzats
        
        HRP (horseradish peroxidase, peroxidasa de rave)
        
        AP (alcaline phosphatase, fosfatasa alcalina)
        
        Radioactiu
        
        Ac conjugat a una molècula radioactiva (isòtop radioactiu).
        
        Es detecten les radiacions emeses pel radioisòtop.