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SAGGI FUNZIONALI, per prevenire: disinfezione con raggi UV o gamma per…

- - - - SF= survival fraction; PF= plate efficiency
- - - - fasi di crescita della coltura primaria:
        
        fase di LATENZA, subito dopo l'espianto, le cellule si devono assestare e ambientarsi alle condizioni post espianto (espianto primario), passando dal vivo a in vitro, il tasso di crescita è rallentato, periodo di durata variabile in base al TIPO CELLULARE.
        
        fase di crescita esponenziale
        
        fase di confluenza= stazionaria tutto lo spazio disponibile è stato occupato, non c'è replicazione attiva; iniziano i meccanismi di SENESCENZA; entrano in senescenza replicativa
        
        morte cellulare -> dopo 20 - 30 passaggi
    - - immortalizzare una coltura: mediante agenti virali, o sostanze chimiche <- TRASFORMAZIONE
        
        fasi di crescita: mancano la fase di confluenza (stazionaria) e la fase di morte cellulare. le cellule i mantengono in fase esponenziale; posso farre uno SPLITTING ddelle cellule, cioè quando sono al 70% della confluenza sono prelevate dalla coltura e ripiastrate, e possono replicarsi, fino a un nuovo splitting. Una coltura immortalizzata è usata per un max ddi 40 passaggi perché poi subentrano (si accumulano ) mutazioni
        
        EFFETTUARE I PASSAGGI -> mediante TRIPSINIZZAZIONE-->uso della tripsina, enzima proteolitico, max 5 min per non mandare in sofferenza le cellule, percio puo essere usato in combinazione con altri enzimi, come collagenasi, ialuronidasi DNAsi, elastasi
        
        protocollo di splitting:
        
        prendere le piastre (o fiasche) dall'incubatore e aspirare il mezzo
        
        lavare le cellule con PBS; aspirare il PBS
        
        aggiungere la tripsna per 5 min a 37°c e incubare
        
        inattivare la tripsina aggiungendo n volume pari a quelllo della tripsina di MEZZO e trasferire la sospensione in un nuovo tubo;
        
        centrifugare a 1500 rpm a RT
        
        aspirare il surnatante e risospendere il pellet in mezzo fresco
        
        aggiungere trypan blu 200 microlittri e mischiare pipettando
        
        afar diffondere per capillarita nella camera di Burker la sospensione
        
        per immortalizzare la coltura: non si deve raggiungere la confluenza, altrimenti le cellule entrano in senescenza e poi si avviano alla morte cell (apoptosi), percio si fanno spliting a confluenze=70%
    - - in sospensione: crescono in un mezzo liquido; non aderiscono alla fiasca, ma sono sospese nel mezzo di coltura-> sistema emopoietico
      - aderenti: restano adese alla superficie di coltura; trattare al superficie per favorire l'adesione es con poli-L-Lys, matrigel -> fibroblasti endoteliali neuronali epiteliali
  - - - non biologici: DMSO (anti congelamento) o un eccesso di ETANOLO
      - biologici:
        
        funghi. Ife visualizzabili al MO, non c'è acidificazione pH, richiede più gg
        
        batteri. causano un'acidificazione: abbassamento di pH; la contaminazione batterica è rapida, si estende da poche ore a 1 giorno; ENDOTOSSINE: rilasciate dai Gram -, possono essere presenti nel mezzo di coltura/tossine nel siero per la preparazione del mezzo
        
        lieviti. C'è una minore acidificazione del terreno rispetto ai batteri;si osservano al MO le catenelle prodotte dalla gemmazione dei lieviti; la contaminazione si estende in 48 h
        
        mycoplasma. infezione da myc. causa un RALLENTAMENTO del tasso di proliferazione(divisione) delle cellule tumorali; se osservo un rallentamento nella proliferazione cellulare, posso sospettare un'infezione da myc, e rilevarla con un KIT specifico oppure con il DAPI <-- legandosi agli acidi nucleici, lascia (oltre a colorare i nuclei cellulari) degli aloni= il genoma di Myc
        
        non sempre è conveniente usare un antibiotico, perché causa alterazioni del genoma, metabolismo, dell'epigenoma, non applicabile se cellule di un paziente, è più oppurtuno buttare la coltura e ricominciare, anche per evitare che l'infezione si estenda