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VESCICOLE EXTRACELLULARI, ISOLAMENTO DA FLUIDI BIOLOGICI: sfruttando la…

- - - - obiettivo: un'analisi MORFOMETRICA e QUANTITATIVA degli esosomi, mediante tecnologia "tunable resisting pulse sensing". Strumento: Qnano Izon Technology
      - Materiali: PBS; BC(= beads di calibrazione); campione Q contente esosomi purificati.
      - Passaggi:
        
        1) pipettare sul nanoporo 50 microlitiri di BC, evitando bolle; regolare SCRETCH con la manopola laterale e la PRESSIONE con lo stantuffo metallico inferiore, prendendo nota dei valori. Con tapping, acquisire almeno 1000 beads. eliminare beads con la P200, e lavare il nanoporo per 2 volte con PBS (50 microlitri)
        
        2) porre sul nanoporo asciutto 50 microlitri di campione Q, evitando bolle. Acquisire con tapping almeno 500 eventi.
        
        Analisi di grafici: variabilisono x= dimensioni del diametro delle vescicole, y= concentrazione vescicole /mL. alcune osservazioni: possono esserci due popolazioni di vescicole (sottopopolazioni), di dimensioni differenti: una da 100 nm di diametro, l'altra in cui il valore modale è di 400 nm, con valore max. di 700. Possiamo vedere il picco di conc.max: 10^8 esosomi/mL. Possiamo vedere particelle di diametro molto piccolo, tra 0 e 40 nm, e sono ECTOSOMI. in generale ne ricaviamo eterogenietà dei preparati
    - - Obiettivo: MARCATURA delle membrane degli esosomi, con molecola fluorescente lipofilica PHK red e MISURAZIONE mediante fluorimetro Qbit e cittofluorimetro MUSE.
        
        Materiale: Soluzione PHK RED; stop solution SS; soluzione standad fluorescete SF; campione P contente esosomi isolati; citofluorimetro MUSE e fluorimentro Qbit
      - passaggi:
        
        1) preparare 3 provette, da 0.5 ml, contenenti 199, 195 e 190 microlitri di SS in cui pipetto rispettivamente 1, 5 e 10 microlitri di SF. Mix a mano, schermare dalla luce.
        
        2) nella provetta P (che contiene gli esosomi), aggiungere 5 microlitri di PHK; mix a mano, trasferire in provetta e incubarea 37 gradi per 5 min. Poi aggiungere 150 microlitri di SS
        
        3) leggere al fluorimetro Qbit le fluorescenze blu e rosse per le prime tre provette e per la provetta P.
        
        4) quindi prelevare 10 microlitri di campione P della lettura Qbit, trasferire in tubo 1.5 mL, aggiungere 50 microlitri dal tubo "MUSE". tagliare tappo e misurare al citofluorimetro muse -> plot dimensionale e istogramma a fluorescenza.
        
        spettro di emissione rosso: 550 - 640 nm al q bit
    - - Obiettivo: MARCATURA di acidi nucleici ALL'INTERNO di esosomi, mediante elettroporazione delle membrane vescicolari; strumento: elettroporatore neon
      - Materiali: elettroporatore neon; intercalante degli acidi nucleici che emette radiazione verde (V); campione N contenente gli esosomi;D-PBS
      - Passaggi:
        
        1) aggiungere 100 microlitri di PBS nel campione N; aggiungere 10 microlitri di intercalante; mischiare delicatamente con la pipetta, senza formare bolle.
        
        2) prelevare 100 microlitri con il puntale NEON ORO ed effettuare elettroporazione; trasferire il conttenuto del puntale (elettroporato) in un nuovo tubo E+
        
        3) misurare al citofluorimetro MUSE il campione E+ (dopo aver tolto il tappo ala provetta); acquisire plot dimensionale e istogramma a fluorescenza
        
        4) trasferire E+ in provetta e leggere al FLUORIMETRO Q BIT e annotare fluorescenze blu e rosse
    - - Procedura:
        
        1) prelevare 200 microlitri della sospensione cellulare e trasferire in esso 50 microlitri del campione P (che contiene gli esosomi marcati con fluorescenza) e allestire un vetrino portaoggetti.
        
        2) incubare per 5 h--> internalizzazione dell'esosoma in una cellula. l'esosoma può essere osservato nella cellula con microscopia a fluorescenza. Cosa mi aspetto di vedere: le cellule presentano piccoli spot a livello delle membrane <- gli esosomi.
      - microscopia in campo chiaro
        
        per l'osservazione di colture cellulari di organoidi, str. 3D date dall'aggregazione di più cellule; risospendere la sospensione cellulare; su vetrino coprioggetto
- - - - le vescicole sono rilasciate nel processo di BUDDING= estroflessione e sono recepite per ENDOCITOSI
      - In base alla fonte di rilascio della vescicola, poi l'acquisizione può essere:
        
        PARACRINA: proveniente da una cellula adiacente
        
        AUTOLOGA: proveniente dalla cellula stessa che la acquisice
        
        SISTEMICA: proveniente da altri organi o distretti dell'organismo
      - puo avvenire comunicazione anche travescicole di organismi diversi: interazione tra vescicole murine e cellule umane, che le importavano!
- - - - nel doppio strato fosfolipidico sono presenti proteine CD; nell membrane degli esosomi l'espressione di CD è maggiore che nelle membrane plasmatiche, perciò le CD sono marcatori per gli esosomi
      - proteine tetraspanine, sono proteine transmembrana, con 4 domini t.m.
    - - ACIDI NUCLEICI: ci sono tutti i tipi di acidi nucleici, t m r micro nc RNA, e/o frammenti di DNA cromosomico
      - proteine: citoplasmatiche; MHC (proteine della risposta immunitaria, conferiscono potenzialità immunostimolatrice all'esosoma)
      - organelli: mitocondrio, o solo mtDNA
- - - - Per quantificare le dimensioni delle vescicole, si usano dei BEADS di controllo, cioè delle piccole sfere di dimensione nota, che servono da controllo: si confrontano le durate dei tempi di decadimento per i beads con quelli delle vescicole e si puo ricavare la dimensione della vescicola . Inoltre -> le vescicole possono avere carica positiva o negativa e diversi valori.