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Tecniche di trascrittomica e genomica - Coggle Diagram

- - - - possibile analizzare una sequenza per volta, un gene per esperimento e un campione per volte
  - - - PacBio, è il più conosciuto, viene frammentato il DNA, frammenti più grossi (30.000basi), ripariamo le estremità alle quali attacchiamo degli adattatori, sono circolari alla cui struttura si lega una polimerasi, si utilizza un primer per fare da innesto iniziando la polimerizzazione,
      - Oxford nanopore, i dati sono disponibili in tempo reale, ciò permette di modificare alcuni Setting nella corsa, quindi si possono sequenziale solo determinate molecole, in modo da rilevare modifiche come la mediazione, il dna viene frammentato (opzionale) alle estremità si attaccano gli adattatori, una proteina motrice, il filamento di dna viene spinta in un poro, essendo quest'ultimo carico cambia il voltaggio ed in base a questo la macchina è in grado di dirti se è entrata una A, una C o una A mutilata. Invertendo la carica del poro provoca una fuoriuscita del filamento di DNA. I nano pori sono presenti nella flow cell (superficie chiusa su cui viene sparato il DNA trattato)
      - Bionano, mappatura in cui si rompono frammenti di dna in frammenti grossi, si marcano con dei florofori che riconosce delle sequenze specifiche di DNA, si lega 20 volte ogni 100.000 paia di basi, vengono marcati in specifici punti creando una "impronta digitale", si effettuano delle elettroforesi in dei capillari, ogni frammento è marcato x volte dai florofori, muovendosi per elettroforesi conosciamo anche la grandezza, si può costruire anche una mappa in cui vi possono anche essere dei ponti di legame,
      - Optical mapping, ha aiutato la risoluzione di alcuni casi clinici, in cui non vi fosse stata una diagnosi accurata, oggi è possibile vedere altre caratteristiche, con l'avanzare delle tecnologie sarà possibile verificare altre mutazioni e quindi malattie genetiche. Ci permette di studiare quasi tutti gli riarrangiamenti, sia in cis o in trans, ci permette di vedere anche se le traslazioni bilanciate o sbilanciate
        
        la Duchenne e la Becker, una terapia è targettare le zone che sono responsabili della produzione del gene e viene sostituito, le differenze tra queste due, che l'out of frame, comporta una completa assenza della distrofina, mentre in frame, produce una distrofia che è parzialmente funzionante, solitamente si cerca di modificare e non sostituire il gene (da Duchenne farla diventare un Becker)
        
        la famiglia A (sana), in uno membro vi era una duplicazione di 5 blocchi del gene della distrofina, come se il gene si fosse conservato ad un certo punto solo per un piccolo pezzo 4 volte, però una copia di distrofia intatta er presente, quindi i figli maschi non hanno la malattia perchè hanno conservato una copia sana del gene, si son aggiunti altri sono (blocchi di distrofia non codifcata), quindi si apprezza solo quante volte si è amplificato, ma questo interessava una parte a valle del gene quindi non influiva. la famiglia B dove vi è un maschio malato, la regione interessata da un riarragniamento, la mamma è carrier, per cui il cromosoma x si è un po' riarrangiato, che si è invertito e si è andato ad inserire nell'altro cromosoma x (questo nella madre), che poi ha trasmesso al figlio creando una distrofina aberrante, non viene proprio prodotta. Con questa tecnica è stato possibile tutta questa combinazione di riarrganimenti, inversioni segmentali avvenute sul cromosoma x nella madre (inversione, riarrangiamento e inserzione)
        
        ricombinazione omologhe che avvengono tra due alleli che poi scivolano provocando un riarrangiamento bilanciato o sbilanciato, i punti di rottura, ciò permette anche di capire la gravità della malattia, (NHEJ e MMRDR)
  - - - gli adattatori, permettono di mettere insieme più campioni, si legano aila flow cell, su di essi si legano primer che fanno da innesto, al loro interno possono avere degli indici per le reazioni di più campioni, vi sono anche i frammenti complementari su cui poi si legano, con ciò è possibile ridurre anche i costi,
      - target enrichment, sequnziamo pannelli ristretti di geni, per ibridazione, catturando gli esosi di geni che vogliamo analizzare, utilizziamo delle biglie magnetiche ricoperte di strptavidina per catturare i frammenti che vogliamo, se di questi frammenti parliamo di tutto lesomi, allora faremo una whole
      - ricerca di mutazioni, se vi sono variazioni del numero di cromosomi, mappare aree del genoma umano e di altri genomi di cui non si era a conoscenza e quindi sequenziale ciò che ancora non conosciamo
- - - - molto più costosa, ci permette di verificare l'espressione geni che si muovono in un alanilis rispetto ad un'altra allora si effettua una analisi trascrittomicaa. In questa tecnica si trasforma rRNA in cDNA (fatto solo per lavorarci), allontaniamo rRNA mediante due tecniche, sfruttando le caratteristiche di una cellula e che queste hanno una coda di poli A, se invece fossimo interessati a sequenziale anche gli rna che non vengono tradotti in proteine ma sono regolartori, non essendo poliadenilati viene utilizzata una tecnica diversa, anche l'integrità del rna influenza la scelta, infatti viene catturato solo un pezzo del trascitto,
        
        vengono quinidi eliminati gli rRNA oppure vengono poliadenilati, questa viene scelta se abbiamo rna di buona qualità, la ribodeplezione è più costosa, il meccanismo delle pole A è lo stesso target enchirment, su queste biglie magnetiche viene applicato oligo dt. Alla fine i geni vengono contati, vengono normalizzati per la lunghezza di ognuno, le librerie vengono normalizzate, vengono quantizzate e infine mappate esprimendo dei livelli uguali o diversi, con una analisi del trascrittomici si può verificare anche al rpesenzad i variazioni nelle isoforme, dovuti a splicing alternativi, si possono ricostruire le quantità di isoforme che hanno causato la malattia. Le reads sono stringe di sequenze, risultato delle analisi, in ognuna di queste righe vi è un frammento sequeznaito che poi viene allineato sul genoma mediante la bioinformatica,
      - si possono effettuare anche ricerche di riarrangiamenti cromosomici (negli introni) permettono di sapere che un pezzo di un gene si è fuso ad un altro
    - - single cell rna sequencing, si verification una media dell'espressione del gene in quel campione, se le cellule sono omogenee o eterogenee. Come tecniche venivano utilizzate diluizioni, oggi viene utilizzato un sortine, in modo salivare alcune caratteristiche n modo da discriminare cellule che appartengono ad un tipo rispetto ad un altro, caratteristiche come la granulosità e la grandezza, in base alla rifrazione dell'impulso siamo in grado di discriminare per esempio macrofagi, linfociti. Si possono misurare anche, mediante uso di marcatori, la positività del recettore se appartenente ad una popolazione o un'altra. Possibile visualizzare i geni più espressi, ma non tutti, anche il numero di cellule possibile da catturare sono 100.000
        
        sorting, citometria a flusso permette di separare le cellule, di porle in pozzetti a seconda delle caratteristiche e della positivià, successivamente si prendeva l rna da questi campioni e si effluvano esami di trascrittomica
        
        separazione mediante microfluidica, comporta costi ridotti, basta effettuare un trascrittoma di singole cellule. Viene caricato il chip con le cellule, vengono diluite e sparate in un liquido oleoso, al cui interno vengono fatte passare delle gocce con delle bigiie, queste bolle conterranno una cellula e una biglia, ciò per prevenire l'entrata di più cellule nelle bolle, successivamente la membrana viene listata e all'interno della bolla di acqua ho il legame con la catena di poli A o per complementarità di sequenza, la cattura serve perchè le biglie sono coperte di adattatori. La rottura di tutte le gocce comporta il mischiarsi di tutti gli rna, per riconoscerli delle rispettive cellule, avviene perchè gli adattatori hanno sequenze specifiche per ogni singola cellula (chiamati bar code), vi è un'altra sequenza marcatrice (UMI), diversi per ogni oligonucleotide che esce, rispetto al bar code dove sarebbero tutti uguali, quindi UMI identifica due trascritti diversi della stessa cellula,
        
        possibile quindi comparare diversi campioni e verificare la composizione dei diversi tipi cellulari di un campione. questa tecnica nasce per trovare i precursori delle cellule del sangue, prima era necessario sapere i marcatori che differenziassero queste cellule dalle altre, oggi il software, verifica e classifica alle cellule, raggruppa le simili e separa le diverse, se si conoscono i marcatori si può precisare e far si che il software le identifichi e le classifichi. Studi applicati anche sulla studio del differenziamento, ci sono anche cellule che assumessero più marcatori, mutazione specifica dovuta al mRNA
        
        marcatura tramite diluizione, le cellule vengono distribuite in pozzetti i bar code entrano all'interno della cellula senza rompere la membrana cellulare, poi tutte le cellule vengono mischiate insieme, vengono separate le cellule, vengon rimesse nei pozzetti, avremo così una composizione di bar code, infine vengono rimescolate insieme, vengono rotte e sequenziale
        
        ambito della medicina personalizzata, mirata a targhettare e definire la presenza di determinati tipi di cellule in modo da spere che tipo di cellula si va bersagliare, in modo da anche da poter discriminare tipi di cellule sane da quelle malate
      - spatial gene expression
        
        vi sono adattatori legati al chip, vi sono i catturati, i bar code sono separati a seconda della grandezza, la suddivisone non è proprio di singola cellula, ma da 1 a 4 cellule, la marcatura sarà di posizione e non di cellula, gli rna vengono marcati con determinati bar code in base a dove cadono, quindi sono riconducibili a quella posizione, ottenendo una ricostruzione con una risoluzione di singola cellula, ma anche spaziale, vengon identificati i cluster e poi associati al tessuto d'origine. Non è molto diffusa come tecnica, è molto costosa
    - - si crea una copia esatta di dna, si utilizzano marcatori a fluorescenza aspecifici, economici, la quantità di fluorescenza è proporzionale al dna detectato. La curva di Meeting, ci permette di capire la tempreatura alla quale il frammento si deve separare, la quale deve essere sempre la stessa. Le real time-PCR, usa un campione di riferimento come un soggetto sano, una cellula con cui abbiamo modificato il genoma, si ha una quanitzzazione relativa,
- - - - vi sono diverse tecniche
        
        FPKM
        
        TPM
        
        più utilizzato, ottenuto una volta normalizzata la matrice di count
        
        RPKM
      - successivamente si misura l'espressione del cambiamento, quando è da regolare varia tra 0 e 1, altrimenti da 1 a +infinito. Una volta calcolato un full change, il P-value indica la probabilità che quell'affermazione si vera o falsa, ciò è possibile applicarlo ai geni, ma avendo un P-value alto su un gran numero di geni avrò molti falsi positivi, per corrgere ciò si utilizza FDR, non cerca la perfezione ma accetta la presenza di una percentuale di falsi positivi, si prende la soglia considerata buona e positiva. Mentre, l'analisi di arricchimento permette di mettere insieme die pathway biologici verificare quanto si alterato, la differenza tra le diverse tipologie sono con quale pathway vuoi lavorare, per ognuno è possibile verificare per ogni pathway la distribuzione di tutti geni di quel pathway e quanto espressi
  - - - il labelling è possibile attuarlo mediante diversi tools, permette di visualizzare un stesso tipo cellulare mettendolo a confronto, abbiamo una risoluzione maggiore sul tipo cellulare, successivamente si fa una analisi differenziale tra paziente e controllo, si prende così una lista dei geni defferenzialmente espressi, con ciò si possono effettuare diverse analisi tra cui l'arricchimento. Permette l'analisi di 3000 geni, si visualizza il trascritto, possibile vedere anche gli splicing alternativi fisiologici, la potenza di questo tool ci permette di vedere gruppi cellulari differenti, uno di controllo e uno dei pazienti si scopre che nei pazienti vi può essere una variazione/sparizione di determinate cellule, vi sono casi in cui le caratteristiche trascrizioni fossero fuse tra le due. Il long non Coding RNA si è scoperto che è fondamentale per la separazione di caratteristiche tra i due gruppi di cellule.
- - - - dai risultati ottenuti si creano delle regioni differenziamento metilate, mediante queste è possibile vedere regioni ipo e iper metilate