Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
élesztők molekuláris biológiai vizsgálatai, vizsgálat menete - Coggle…
élesztők molekuláris biológiai vizsgálatai
Az élesztők genomi felépítése
extrakromoszomális elemek
mitokondriális genom
citoplazma plazmidok
dsRNS (lienáris)
M-dsRNS
killer toxin (2kb)
L-dsRNS
vírus partikulum és a plazmid sokszorozódásához kellő elemek (4kb)
kromoszomális elemek
PCR
RAPD
tipizálás
pár (2db)
10-15 nukleotid
nincs
~50 fok
nem
több
RFLP
identifikálás
egy primer
18-20 nuklotid
van
36-40 fok
igen
egy
túlajdonságok
cél
Primer db
Primer hossz
Primer specifitás
Annelálási T
tervezetség
Termék
fizikai vízsgálatok
gélelektroforézis
kivitelezése
agaróz
1g
agaróz elekroforetizáló gél
eredmény
R-Green
3,5 μl
TBE puffer
100 ml
kiértékelése
transziluminátoros előhívás és kép alkotás
softveres értékelés
nano drop
mérés 260 nm-en
nukleinsav tartalom meghatárózás
c(nukleinsav)=50 μg/ml és 1cm-es küvetta
OD=1
mérés 260/280 nm-en
izolát nukleinsav tisztaságának meghatárózása
RNS és fehérje molekula szennyezés
1,0 és 1,2 közötti értéket szoktunk alkalmazni a gyakorlatban
RN-ázos emésztés
RN-áz koncentráció
1 mg/ml
ds RNS jóbb emésztése
5μg/ml
ss RNS könnyű emésztése
RNS típusok
nukleinsavak izolálása
alkalmazott eszközök
Breaking puffer
sejtfal feltárás
TE puffer
nukleázok inaktiválása
Kloroform-izoamil alkohol (24:1)
szemezések kimosása
Telített fenol oldat
fehérjék kicsapása
YEPD agar
élesztők szaporítása
vizsgálat menete
Összes nukleinsav izolálása
YEPD agra tenyészetből vett 2 kacsnyi mintát 1,5 ml vízzel szuszpendáljuk
A szuszpenziót két percig maxon centrifugával ülepitjük
A felüluszot leöntjük
Hozzá adunk 150 μl telített fenolt és 150 μl kloroform-izoamil oldat (24:1)
A sejtekhez hozzáadunk 300 μl Breaking puffer + 0,3g üveggyöngy hozzáadása a sejthez
3 perc centrifugázás maxon
200 μl TE-t adunk hozzá, majd lecentrifugáljuk 5 perc maxon
A felső fázishoz hozzámérünk 300 μl kloroform-izoamil alkohol (24:1)
2 perc vortex maxon
A felülúszón kivűl két térfogatnyi (kb. 1ml) 96%-os etanolt adunk hozzá a felülúszóhoz
1 more item...
nukleinsav izolálása
Az 50 kb-nál kisebb nukleinsavaknál használjuk az agrarózgélt
ehhez 1%-os agraróz gélt használunk
2-7 μl a nukleinsav izolátumot, melyhez 3 μl Loading puffert adunk, ezt kiegészítjük 10 μl-ig.Az összeállított elegyet gélben bemérünk.
10 μl méretmarkert hozzáadunk
120 V-on futatjuk a gél 3/4 részéig
UV transzliminátoros elemzés
Quantity One gélfényképező software
RN-ázos emésztés
5-5 μl nukleinsav izolátumot kezelünk
10 mg/ml-es RN-áz oldatot felhígitunk
1 mg/ml-es RN-áz
5 μg/ml RN-áz
Az izolátumhoz hozzáadunk 1 μl hígitott RN-ázt, majd ezt 10 μl-re kiegészítjük
37 fokon egy óránát a szárazblokkba inkubáljuk.
elkészítjük az 1%-os agarózgélt
Majd ezek után 5 μl Loading puffert adunk a mintához
Az oldatok felvítele az agróz gélbe, majd 120 V-on megfuttatjuk
RAPD-PCR analizise
A tárolt izolátumot használjuk
Bekapcsoljuk a PCR fülkében lévő UV lámpát és 20 percig üzemeltetjük
Összeállítjuk a Master Mix-et
hozzáadun bidesztilálltvízzel 30 μl-re kiegészítjük.
bemérjük a kellő (1μl) Master Mixet és hozzáadunk DNS izolátumot
Programozzuk be a PCR készüléket
Elkészítjük az 1,5%-os agaróz gélt.
A mintából 8 μl mintához adunk hozzá 4 μl Loading festéket
1 more item...