Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
ELETTROFORESI SU GEL D'AGAROSIO - Coggle Diagram
ELETTROFORESI SU GEL D'AGAROSIO
INTRO
NELL'ELETTROFORESI SU GEL I CAMPIONI VENGONO SEPARATI FACENDOLI CORRERE IN UN GEL ATTRAVERSO L'APPLICAZIONE DI UN CAMPO ELETTRICO.
(LE MOLECOLE DI DNA e RNA HANNO LA STESSA QUANTITA' DI CARICA X MASSA. QUESTO SIGNIFICA, IN PAROLE SEMPLICI, CHE TUTTI I FRAMMENTI DI DNA HANNO "+ O - LA STESSA SPINTA ELETTRICA". X QUESTO MOTIVO, NEL GEL SI SEPARANO SOPRATTUTTO IN BASE ALLE DIMENSIONI: I FRAMMENTI PICCOLI CORRONO VELOCI, QUELLI GRANDI CORRONO LENTI)
E' UNA TECNICA DI LABORATORIO CHE PERMETTE DI SEPARARE GLI ACIDI NUCLEICI, IN BASE ALLE LORO DIMENSIONI E ALLA LORO CARICA ELETTRICA
PROCEDIMENTO
3.
CARICAMENTO DEI POZZETTI:
NEI POZZETTI SI CARICANO I CAMPIONI E ANCHE IL DNA LADDER, CIOE' UNA MISCELA DI FRAMMENTI DI DNA DI DIMENSIONI NOTE CHE SERVIRA' COME RIFERIMENTO:
FACENDO MIGRARE I CAMPIONI ACCANTO AL LADDER, E' POSSIBILE CONFRONTARE LE BANDE OTTENUTE CON QUELLE DEL LADDER E STIMARNE LA LUNGHEZZA IN PAIA DI BASI
I CAMPIONI VENGONO MESCOLATI CON UN BUFFER DI CARICAMENTO, ESSO SERVE A:
APPESANTIRE I CAMPIONI E FARLI DEPOSITARE BENE SUL FONDO DEL POZZZETTO
PERMETTERE DI SEGUIRE VISIVAMENTE LA CORSA SUL GEL ED ACCORGERSI DI QUANDO LA CORSA ELETTROFORETICA E' TERMINATA
4.
APPLICAZIONE DEL CAMPO ELETTRICO:
SUCCESSIVAMENTE, BISOGNA COLLEGARE GLI ELETTRODI ALLA CORRENTE X PERMETTERE ALLA CORRENTE DI INIZIARE A FLUIRE ATTRAVERSO IL GEL E QUINDI FAR PARTIRE LA CORSA ELETTROFORETICA.
LE MOLECOLE DI DNA, CHE HANNO GRUPPI FOSFATO NEGATIVI, MIGRANO VERSO L'ANODO (POLO POSITIVO).
5.
MIGRAZIONE E SEPARAZIONE:
LA SEPARAZIONE AVVIENE PRINCIPALMENTE IN BASE ALLA DIMENSIONE: I FRAMMENTI + PICCOLI MIGRANO + VELOCEMENTE ATTRAVERSO I PORI DEL GEL, QUELLI + GRANDI AVANZANO + LENTAMENTE.
SI FORMANO COSI' BANDE DISTINTE ALL'INTERNO DEL GEL.
6.
VISUALIZZAZIONE:
CONFRONTANDO LA POSIZIONE DELLE BANDE CON IL DNA LADDER (MARCATORE DIMENSIONALE) E' POSSIBILE ATIMARE LA LUNGHEZZA DEI FRAMMENTI IN PAIA DI BAS
ILLUMINANDO IL GEL CON LUCE UV, I COLORANTI EMETTONO FLUORESCENZA E LE BANDE DIVENTANO VISIBILI.
(I COLORANTI POTREBBERO ESSERE AGGIUNTI DIRETTAMENTE NELLA PREPARAZIONE DEL GEL O AGGIUNTI AI CAMPIONI DI DNA PRIMA DEL LORO CARICAMENTO NEI POZZETTI)
X VISUALIZZARE I FRAMMENTI SI UTILIZZANO I COLORANTI FLUORESCENTI INTERCALANTI (SI INSERISCONO TRA LE BASI DEL DNA).
2.
ALLESTIMENTO DELLA CELLA ELETTROFORETICA:
IL TAMPONE PERMETTE IL PASSAGGIO DI CORRENTE PERCHE' CONTIENE IONI CHE TRASPORTANO LA CARICA DA UN ELETTRODO ALL'ALTRO.
UNA VOLTA SOLIDIFICATO, IL GEL VIENE POSIZIONATO NELLA CELLA ELETTROFORETICA (UNA VASCA CON ELETTRODI COLLEGATI A UN POLO POSITIVO E A UN POLO NEGATIVO) E RICOPERTO CON UN TAMPONE DI CORSA (RUNNING BUFFER), CHE SPESSO E' LO STESSO TBE.
1.
PREPARAZIONE DEL GEL:
SI SCIOGLIE LAGAROSIO IN UNA SOLUZIONE TAMPONE COME TBE o TAE (ad alta temperature); QUESTI TAMPONI CONTENGONO:
TRIS
(MANTIENE IL pH COSTANTE),
ACIDO BORICO
(FORNISCE LA FORZA IONICA NECESSARIA X CONDURRE CORRENTE, X FARE MIGRARE I FRAMMENTI),
EDTA
(LEGA IL MAGNESIO E PROTEGGE GLI ACIDI NUCLEICI DALLE DNAsi). LA SOLUZIONE VIENE RISCALDATA, IN UN MICROONDE O SU UNA PIASTRA RISCALDANTE, FINO A COMPLETA DISSOLUZIONE, DIVENTANDO TRASPARENTE.
SI LASCIA SOLIDIFICARE IL GEL NELLO STAMPO (RICORDARSI DI INSERIRE UN PETTININO PRIMA CHE IL GEL SOLIDIFICHI).
SI PESA LA POLVERE DI AGAROSIO (UN POLISACCARIDE CHE VIENE ESTRATTO DA UN'ALGA)
PRIMA CHE IL GEL SI SOLIDIFICHI, SI AGGIUNGE UN COLORANTE INTERCALANTE, COME
BROMURO DI ETIDIO
o
SYBR GREEN
, CHE SERVE X VISUALIZZARE LE BANDE DI DNA (SOTTO LUCE UV I FRAMMENTI DIVENTANO FLUORESCENTI E VISIBILI).
A LIVELLO MOLECOLARE, POSSIAMO IMMAGINARE IL GEL COME UNA RETE DI PORI, I QUALI CONSENTONO DI SEPARARE LE MOLECOLE IN BASE ALLA LORO GRANDEZZA.
IL GEL QUINDI FUNGE DA SETACCIO.
LA LARGHEZZA DELLE MAGLIE DEL GEL DIPENDE DALLA CONCENTRAZIONE DI AGAROSIO (SCELTA IN BASE AL TIPO DI MOLECOLE DI DNA CHE SI VUOLE ANALIZZARE):
MOLECOLE DI DNA DI GRANDI DIMENSIONI NECESSITANO DI PORI + GRANDI, QUINDI UTILIZZEREMO UNA BASSA CONCENTRAZIONE DI AGAROSIO
MOLECOLE DI DNA DI PICCOLE DIMENSIONI NECESSITANO DI PORI + PICCOLI, QUINDI UTILIZZEREMO UN'ALTRA CONCENTRAZIONE DI AGAROSIO