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PCR - Coggle Diagram
PCR
PROCESSO
X FORMARE L’INNESCO SI UTILIZZANO 2 PRIMER (BREVE FRAMMENTO DI DNA A SINGOLA ELICA), 1 FORWARD E 1 REVERSE,
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LA REAZIONE DI PCR AVVIENE ALL’INTERNO DEL TERMOCICLATORE, CHE VA A REGOLARE LE DIVERSE TEMPERATURE NECESSARIE.
LA DNA POLIMERASI, PERÒ, X POTER AGIRE, HA LA NECESSITA DI RICONOSCERE UNA REGIONE A DOPPIO FILAMENTO SEGUITA DA UNA REGIONE A SINGOLO FILAMENTO, OVVERO UN INNESCO.
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UTILIZZIAMO DNA POLIMERASI APPARTENENTI AD ORGANISMI TERMOFILI, X POTER SOPPORTARE LE ALTE TEMPERATURE, COME LA TAQ POLIMERASI.
IL FILAMENTO MANCANTE VIENE SINTETIZZATO A PARTIRE DA NUCLEOTIDI DISPOSTI IN MANIERA COMPLEMENTARE AL SINGOLO FILAMENTO.
LA PCR È UNA REAZIONE CICLICA, COSTITUITA DA 25-35 CICLI, OGNUNO CARATTERIZZATO DA 3 PASSAGGI SUCCESSIVI:
- DENATURAZIONE, 94° - 99°, IN CUI IL DOPPIO FILAMENTO SI SEPARA
- ANNEALING, 50°-60°, IN CUI I PRIMER AGGANCIANO LA SEQUENZA COMPLEMENTARE
- ESTENSIONE, 72°, IN CUI LA DNA POLIMERASI ANDRÀ AD AGGIUNGERE I NUCLEOTIDI COMPLEMENTARI
LA PROTAGONISTA È LA DNA POLIMERASI, CHE A PARTIRE A UN FILAMENTO A SINGOLA ELICA, È IN GRADO DI SINTETIZZARE UN SEGMENTO DI DNA A DOPPIA ELICA.
DOPO IL 1^ CICLO, DA 1 MOLECOLA NE OTTENIAMO 2,
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A SECONDA DELL’INTENSITÀ DELLE BANDE DI DNA AMPLIFICATO, POSSIAMO OPERARE UNA QUANTIFICAZIONE VISIVA.
PCR- REAL TIME
IL SYBR GREEN SI LEGA AL DNA DURANTE LA FASE DI ANNEALING, IN MANIERA ASPECIFICA.
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TRA LE SONDE + USATE, INVECE, ABBIAMO:
SONDE DUAL-LABELED, TAQMAN / SONDE SCORPION / SONDE FRET / SONDE MOLECULAR BEACONS
CON LA PCR-REAL TIME, AD OGNI CICLO IL DNA VIENE AMPLIFICATO E ALLO STESSO TEMPO QUANTIFICATO, GRAZIE ALL’UTILIZZO DI COLORAZIONI FLUORESCENTI O SONDE.
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TAQMAN
NELLA FASE DI ESTENSIONE, L’ATTIVITÀ DELLA TAQ POLIMERASI DEGRADA LA SONDA, R E Q SI STACCANO DALLA SONDA
→ I FOTONI DEL R NON VENGONO PIÙ ASSORBITI DAL Q ED EMETTONO FLUORESCENZA, CHE VIENE CAPTATA IN TEMPO REALE ALL’INTERNO DEL TERMOCICLATORE.
ATTRAVERSO UN SOFTWARE, I DATI APPARTENENTI ALLA FLUORESCENZA VENGONO CONVERTITI IN UN GRAFICO, CURVA DI AMPLIFICAZIONE.
QUINDI DURANTE LA FASE DI ANNEALING, SIA PRIMERS CHE SONDA VANNO AD IBRIDARSI AI TRATTI COMPLEMENTARI (R E Q SONO ANCORA LEGATI ALLA SONDA).
QUANDO I FLUOROCROMI SONO LEGATI ALLA SONDA, I FOTONI EMESSI DAL R VENGONO ASSORBITI DAL Q.
TALE CURVA VIENE ANCHE CHIAMATA AMPLIFICATION PLOT, DOVE POSSIAMO OSSERVARE:
-BASELINE, PRIMI CICLI DOVE IL PRODOTTO AMPLIFICATO È TROPPO POCO
-CT , CYCLE THRESHOLD, CICLO IN CUI LA FLUORESCENZA COMINCIA AD AUMENTARE
RISPETTO ALLA BASELINE (IL SUO VALORE È INV. PROP. ALLA QUANTITÀ DI DNA INIZIALE).
-NELLE ASCISSE IL NUMERO DI CICLI, NELLE ORDINATE L’INTENSITÀ DELLA FLUORESCENZA
-LINEA SOGLIA, SCELTA DALL’OPERATORE X INDICARE IL PUNTO IN CUI INIZIA LA FASE ESPONENZIALE
ANCHE IN QUESTO CASO ABBIAMO FASE ESPONENZIALE, LINEARE E DEL PLATEAU.
ALL’ESTREMITÀ 5’ POSSIEDE UN REPORTER, FLUOROCROMO AD ALTA ENERGIA;
ALL’ESTREMITÀ 3’ È LEGATO UN QUENCHER, FLUOROCROMO A BASSA ENERGIA.
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INTRO
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A PARTIRE DA UNA SINGOLA MOLECOLA DI DNA, SI POSSONO OTTENERE MILIARDI DI FRAMMENTI IDENTICI, PER POTER STUDIARE IL TARGET NEL DETTAGLIO.
LA PCR È UNA TECNICA DI BIOLOGIA MOLECOLARE CHE CONSENTE DI AMPLIFICARE RIPETUTAMENTE UN TRATTO SPECIFICO DI DNA,
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FASI
- FASE LINEARE, L’EFFICIENZA DELL’AMPLIFICAZIONE INIZIA A DIMINUIRE PERCHÉ I REAGENTI COMINCIANO AD ESAURIRSI; IL PRODOTTO AMPLIFICATO CONTINUA AD AUMENTARE, MA LA REAZIONE DIVENTA MENO EFFICIENTE
- FASE ESPONENZIALE, DOVE LA QUANTITÀ DI DNA INIZIALE RADDOPPIA IN MODO ESPONENZIALE AD OGNI CICLO, DATO L’ECCESSO DI REAGENTI PRESENTI
- FASE DEL PLATEAU, LA REAZIONE GIUNGE AL TERMINE X MANCANZA DI REAGENTI O X LA FORMAZIONE DI STRUTTURE SECONDARIE CHE IMPEDISCONO DI PROSEGUIRE. LA QUANTITÀ DI PRODOTTO PCR RIMANE COSTANTE
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