Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
EXPRESSIÓ DE PROTEÏNES RECOMBINANTS I TERÀPIA GÈNICA - Coggle Diagram
EXPRESSIÓ DE PROTEÏNES RECOMBINANTS I TERÀPIA GÈNICA
Introducció proteïnes
Poden patir modificacions post-traduccionals.
Modificacions post-traduccionals: Es realitzen a l'AG en eucariotes. Les procariotes no es poden utilitzar per realitzar aquestes modificacions perquè no tenen AG.
1. Acilació
→ + un grup
acil
.
2. Fosforilació
→ + un grup
fosfat
. Activació/Desactivació enzimàtica (kinases).
3. Metilació
→ + un grup
metil
.
4. Hidroxilació
→ + grup
hidròxil
.
5. Glicosilació
→ + un
glúcid
.
6. Glicació
→ Modificació no enzimàtica dels grups
amino
de les proteïnes per l'acció de sucres reductors.
N'hi ha que estan relacionades amb malalties
Es poden aïllar i purificar
Els eucariotes tenen una gran variabilitat proteica
DNA → Gens: 25.000
RNA → Transcriptomes: 100.000
Després de modificació Post-Traduccional → 1.000.000 proteïnes
Proteoma: estudi del grup complet de proteïnes d'un organisme.
Són responsables de la majoria de funcions cel·lulars
Reconeixement
. Ex: Anticòs
Estructural
. Ex: Tubulina (dímers de tubulina formen microtúbuls)
Transportadores
. Ex: Hb
Enzims
.
Reguladores
. Ex: Hormones
Definició
Proteïna recombinant:
Són aquelles que s'obtenen de l'expressió d'un gen clonat a una espècie o línia cel·lular distinta a la cèl·lula original.
Ús d'organismes vius per la producció d'un producte biotecnològic.
L’expressió de prot. recombinants és un procés complex. S’han d’ajustar moltes variables per optimitzar el rendiment i obtenir prot. solubles i funcionals.
Aplicacions
Expressió de gens o seqüències d'interés
Aplicacions industrials: producció de proteïnes
Teràpia gènica
Definició
Tècnica terapèutica utilitzada per introduir un gen funcional a les cèls d’un pacient amb l'objectiu de corregir un defecte genètic causant d’una malaltia, (hemofilia, anèmia falciforme…).
Aplicacions
Experimentals
Malaltia coronària, etc
Tractament del càncer
Gens supressors de tumors
Car-T: Cèls T (limfòcits) del pacient es modifiquen genéticament a través de la tecnologia del DNA recombinant per expressar receptors específics que reconeixen i ataquen cèls canceroses.
SIDA
Punteres
TG de cèls germinals
Modifica la dotació genètica d’òvuls i espermatozous o d’embrions.
No s’ha fet mai en humans.
TG de cèls somàtiques
Modificació de la dotació genètica de cèl·lules no germinals.
S’utilitzen sota protocols clínics.
Objectius
Inhibir o bloquejar el funcionament de gens implicats en el desenvolupament de la malaltia. Ex: Oncogens
Introduïr material genètic a les cèl. que permeti produir una proteïna que tingui efecte terapèutic nou. Ex: proteïna que obstaculitzi la replicació d’un virus. Ex: SIDA, Adenovirus(episomes)
Complementar o substituir un gen defectuós introduint una còpia normal a les cèl., normalment mitjançant vectors virals.
Ex: distrofia muscular de Duchenne
Modificació gènica, mutagènesi dirigida
Eines
-La teràpia gènica treballa tant com amb
fragments de material genètic
com amb els
vectors
per introduir aquest material, en quantitats suficients i amb integritat.
-Actualment els vectors, millorables, són de tipus virals, tb liposomes.
-S’eliminen els gens virals i es substitueixen pel gen d’interès. Així s'aprofita l’eficàcia del virus per entrar a les cèl.
Modus d'acció
In vivo
(interior del cos)
S’injecta el vector terapèutic a la part del cos on hi han les cèl. defectuoses.
Ex vivo
(exterior del cos)
A partir de sang, medul·la òssia, teixits i separant tipus de cèls específiques al laboratori. Mitjançant cultius cel·lulars, es fan reproduir i es tornen a injectar al pacient.
Malalties tractades
Oftalmològiques
Amaurosi congènita de Leber (LCA 1O)
Neuromusculars
Distrofia muscular de Duchenne
Hematològiques i oncològiques
Limfoma de cèls B
Mieloma múltiple
Leucèmia linfoblàstica aguda (car-t)
Hemofilia A
Metabòliques
Fibrosi quística
Genètiques rares
Síndrome de Wiskott-Aldrich
Beta-talassèmia
Deficiencia de adenosina desaminasa (ADA)
Anèmia de cèls falciformes
Epidermòlisi bullosa distròfica
Edició del genoma
Definició
Tècnica molt recent, basada en l’edició del genoma, exemple
CRISPR-Cas9
, utilitza un enfoc diferent per corregir diferències genètiques.
La proteïna Cas9 és una endonucleasa.
En lloc d’introduir un nou material genètic a les cèl, l’edició del genoma introdueix eines moleculars per canviar l’ADN existent a la cèl.
S'estudia per
Activar un gen per ajudar a lluitar contra la malaltia.
Desactivar un gen que no està funcionant adequadament.
Reparar una alteració genètica relacionada amb un transtorn, per que el gen pugui funcionar apropiadament.
Separar un nucleòtid d’ADN que està impedint el correcte funcionament, i és causant de la malatia.
Factors que impacten en la expressió de proteïnes recombinants
2. Seqüència:
Optimització de codons. Diferents codons = mateix aminoàcid
3. Vector:
Triar l'adequat, millorar el rendiment.
1. Propietats de la proteïna:
Solubilitat,conformació, toxicitat, degradació….
4. Sistema d'expressió:
Hoste
Característica de la proteïna: Pes molecular, modific.post-trad.
Aplicacions: Investigació, terapèutiques...
Rendiment
Cost
6. Condicions d'expressió:
optimització
Composició del medi
Tª
Concentració i tipus d'inductors: IPTG
Temps d'inducció i expressió
Moment d'inducció: Cal induir l'expressió de la proteïna recombinant quan les cèls es troben en
fase exponencial
perquè en afegir
IPTG
al medi fem que el creixement bacterià s'aturi.
5. Soca o línia cel·lular
Factors a tenir en compte per aïllar i purificar la proteïna d'interés
Densitat de càrrega (+ o -)
Mida
Purificació per afinitat
Hidrofobicitat
Precipitació
Es realitza la cromatografia per la purificació de la proteïna
Producció d'insulina humana en
Escherichia Coli
Producció natural d'insulina
Proinsulina
(prot. precursora)
cadena A
cadena B
Unió per ponts disulfur
Insulina madura
Producció recombinant d'insulina
2 Rutes
Producció separada de ambdues cadenes A i B (2 soques diferents)
Associació química
(pont disulfur)
Insulina
Producció de proinsulina
(forma biológica)
Mètode enzimàtic
Insulina
Insulina→51aa
cadena A → 21 aa
cadena B → 30aa
Procediment de recuperació
d'insulina
Introducció del vector amb gen Insulina en
E.coli
Transcripció i traducció a proteïna (IPTG)
Recuperació bacteris –FILTRACIÓ (tècnica per aïllar bacteri)
Alliberament productes protèics (Prot. fusió/cos d’inclusió)
PROTEÏNES
PROTEÏNES D'INTERÉS
INSULINA
Cromatografia
(purificació)
Diferents tipus segons
3 more items...
Definició
1 more item...
Eficàcia del procediment
3 more items...
Centrifugació diferencial
Les proteïnes d'interés es solen unir a prot. petites pròpies del bacteri i són
prot. de fusió
. Juntes formen el
cos d'inclusió
.
Trencament cel·lular
Producció de la vacuna contra el VPH en
Saccharomyces cerevisiae
Procediment
2️. Enginyeria genètica per produir L1:
El gen L1 del VPH s'insereix en vectors d'expressió en cèl·lules hoste. S'utilitzen sistemes d'expressió recombinant a:
Llevats
Saccharomyces cerevisiae
(exemple: vacuna Gardasil).
Cèl·lules d'insecte amb baculovirus (exemple: Cervarix).
3. Producció de partícules similars al virus (VLPs):
Les cèl·lules recombinants sintetitzen la proteïna L1, que espontàniament s'acobla en VLPs. Aquestes partícules imiten l'estructura del virus, però no contenen ADN viral, per la qual cosa són segures.
1. Identificació de l'antigen clau:
La proteïna L1 de la càpside del VPH és la responsable principal d'induir una resposta immune protectora.
4. Purificació i formulació:
Les VLPs es purifiquen i es combinen amb adjuvants per potenciar la resposta immune (Ex. alumini a Cervarix).
5️. Proves preclíniques i clíniques
VLPs
Definició
Partícules similars a virus (VLPs = Virus Like Particles)
Complexos de proteïnes víriques
estructurals
produïdes per la tecnologia de ADN recombinant.
Característiques
Estimulen la resposta immune
Aplicacions: vacunes, administració de fàrmacs
No tenen material genètic
Producció recombinant en
E. coli
Clonatge del gen
SERPINC1
(codificant per AT) dins del plàsmid pQE-30
Transformació del plàsmid pQE a la soca
E. coli
BL21 (DE3)
Creixement bacterià i inducció de l'expressió de
SERPINC1
Purificació de la proteïna AT
Verificació de l'activitat de l'AT mitjançant assajos de coagulació (coagulòmetre)
Teràpia Gènica vs Edició Genoma
Objectiu
La terapia gènica busca corregir o compensar una anomalia genètica i restaurar la funció d’un gen defectós introduïr gens que produeixin una resposta terapeutica desitjada.
L’edició del genoma busca modificar seqüències específiques d’ADN per aconseguir un canvi a la funció gènica, corregir mutacions o inactivar gens no desitjats o introduir noves funcions genètiques.
Mètodes
La terapia gènica utilitza vectors per entregar gens terapèutics. virus modificats (vectors virals)
L’edició del genoma utiliza tècniquess com CRISPR-Cas9 per tallar i editar seqünciees d’ADN, utilitza una proteïna, Cas9, i una guía(guides) d’ARN per tallar i editar seqüències específiques d’ADN.
Enfoc
La terapia gènica s’enfoca en la introducció de gens específics per tractar una malatia.
La edició del genoma es centra en la modificació directa de les seqüencies d’ ADN existents.