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EPATOLOGIA MOLECOLARE 2 - Coggle Diagram
EPATOLOGIA MOLECOLARE 2
ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO
UNA VOLTA PRONTO, IL GEL VIENE IMMERSO NELLA VASCA ELETTROFORETICA RIEMPITA DI TAMPONE CONDUTTIVO E COLLEGATO A UNA FONTE DI CORRENTE.
LA PROCEDURA COMINCIA PREPARANDO IL GEL, SCIOGLIENDO L’AGAROSIO IN UNA SOLUZIONE TAMPONE COME TAE O TBE E LASCIANDOLO SOLIDIFICARE IN UNO STAMPO CON UN PETTINE CHE CREA PICCOLI POZZETTI.
LA VELOCITÀ CON CUI SI MUOVONO DIPENDE DALLA DIMENSIONE:
I FRAMMENTI PIÙ PICCOLI RIESCONO A PENETRARE MEGLIO NELLA MAGLIA DEL GEL E AVANZANO PIÙ VELOCEMENTE, MENTRE QUELLI PIÙ GRANDI SONO RALLENTATI.
L’AGAROSIO, UN POLISACCARIDE ESTRATTO DA ALGHE ROSSE, UNA VOLTA SOLIDIFICATO FORMA UNA MATRICE POROSA CHE FUNZIONA DA SETACCIO MOLECOLARE.
INSIEME AI CAMPIONI SI INTRODUCE UN MARCATORE DI PESO MOLECOLARE, CHIAMATO DNA LADDER,
CHE CONTIENE FRAMMENTI DI LUNGHEZZA NOTA E SERVE COME RIFERIMENTO.
UNA VOLTA PRONTO, IL GEL VIENE IMMERSO NELLA VASCA ELETTROFORETICA RIEMPITA DI TAMPONE CONDUTTIVO E COLLEGATO A UNA FONTE DI CORRENTE.
LE MOLECOLE DI DNA POSSIEDONO UNA CARICA NEGATIVA GRAZIE AI GRUPPI FOSFATO E, QUANDO VENGONO POSTE IN UN CAMPO ELETTRICO, MIGRANO VERSO IL POLO POSITIVO, CIOÈ L’ANODO.
L’APPLICAZIONE DEL CAMPO ELETTRICO METTE IN MOTO I FRAMMENTI, CHE SI SPOSTANO NEL GEL SECONDO LA LORO GRANDEZZA.
L’ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO È UNA TECNICA UTILIZZATA PER SEPARARE MOLECOLE DI ACIDI NUCLEICI, DNA O RNA, SFRUTTANDO LE LORO PROPRIETÀ CHIMICO-FISICHE.
IN QUESTI POZZETTI VENGONO CARICATI I CAMPIONI DI DNA, CHE SONO MESCOLATI CON UN COLORANTE E UN AGENTE DENSO CHE NE FACILITA IL DEPOSITO.
L’APPLICAZIONE DEL CAMPO ELETTRICO METTE IN MOTO I FRAMMENTI, CHE SI SPOSTANO NEL GEL SECONDO LA LORO GRANDEZZA.
PER VISUALIZZARE IL DNA, SI USANO COLORANTI INTERCALANTI COME IL BROMURO DI ETIDIO O ALTERNATIVE PIÙ SICURE COME SYBR GREEN E GELRED.
QUESTE MOLECOLE SI INSERISCONO TRA LE BASI DEL DNA E DIVENTANO FLUORESCENTI QUANDO ESPOSTE A UNA SORGENTE LUMINOSA, GENERALMENTE UN TRANSILLUMINATORE A RAGGI UV O A LED BLU.
IN QUESTO MODO, SUL GEL COMPAIONO BANDE LUMINOSE CORRISPONDENTI AI DIVERSI FRAMMENTI.
DOPO LA CORSA ELETTROFORETICA IL DNA, CHE È STATO COLORATO CON UN INTERCALANTE FLUORESCENTE (PER ESEMPIO BROMURO DI ETIDIO, SYBR GREEN O GELRED), VIENE VISUALIZZATO GRAZIE A UN TRANSILLUMINATORE.
TRADIZIONALMENTE SI USA UN TRANSILLUMINATORE A LUCE ULTRAVIOLETTA (UV):
IL COLORANTE INSERITO TRA LE BASI DEL DNA EMETTE FLUORESCENZA QUANDO VIENE COLPITO DAI RAGGI UV, PERMETTENDO DI OSSERVARE LE BANDE SUL GEL.
IL RISULTATO VIENE INTERPRETATO OSSERVANDO IL NUMERO DI BANDE, CHE INDICA QUANTI TIPI DI FRAMMENTI SONO PRESENTI, LA LORO POSIZIONE, CHE CONFRONTATA CON IL LADDER PERMETTE DI STIMARE LA DIMENSIONE IN PAIA DI BASI, E L’INTENSITÀ DEL SEGNALE, CHE FORNISCE UN’INDICAZIONE APPROSSIMATIVA DELLA QUANTITÀ DI DNA.
L’ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO È UNO STRUMENTO FONDAMENTALE IN BIOLOGIA MOLECOLARE PERCHÉ CONSENTE DI VERIFICARE L’ESITO DI UNA PCR, CONTROLLARE DIGESTIONE CON ENZIMI DI RESTRIZIONE, ANALIZZARE PLASMIDI O COSTRUTTI CLONATI E PERSINO STUDIARE CAMPIONI FORENSI O DIAGNOSTICI.
CARICAMENTO DEI CAMPIONI SU GEL E VISUALIZZAZIONE DEI PRODOTTI
AMPLIFICATI SU TRANSILLUMINATORE
UNA VOLTA CONCLUSA L’ELETTROFORESI, OCCORRE RENDERE VISIBILI I PRODOTTI AMPLIFICATI.
OSSERVANDO LA LORO POSIZIONE RISPETTO AL MARCATORE, È POSSIBILE STIMARE LA LUNGHEZZA DEI FRAMMENTI OTTENUTI DALLA PCR.
LA LORO INTENSITÀ, INVECE, DÀ UN’INDICAZIONE QUALITATIVA DELLA QUANTITÀ DI DNA PRESENTE.
SE LE BANDE SONO NETTE E DI DIMENSIONE ATTESA, IL RISULTATO È SODDISFACENTE;
SE INVECE COMPAIONO BANDE AGGIUNTIVE, MOLTO CORTE O MOLTO LUNGHE RISPETTO A QUELLA ATTESA, SI PUÒ SOSPETTARE LA FORMAZIONE DI AMPLIFICAZIONI ASPECIFICHE.
IN PARALLELO, VIENE CARICATO ANCHE UN MARCATORE DI PESO MOLECOLARE, DETTO LADDER, CHE SERVE DA RIFERIMENTO PER STIMARE LA DIMENSIONE DEI FRAMMENTI CHE SI STANNO ANALIZZANDO.
DOPO AVER APPLICATO LA CORRENTE, I FRAMMENTI DI DNA INIZIANO A MIGRARE NEL GEL:
QUELLI PIÙ PICCOLI PENETRANO PIÙ FACILMENTE NELLA MATRICE E SI SPOSTANO PIÙ VELOCEMENTE, MENTRE QUELLI PIÙ GRANDI RESTANO INDIETRO.
POICHÉ IL DNA NON È VISIBILE A OCCHIO NUDO, SI UTILIZZANO DEI COLORANTI FLUORESCENTI CHE SI LEGANO AGLI ACIDI NUCLEICI.
UNA VOLTA PRONTO, IL CAMPIONE VIENE ASPIRATO CON UNA MICROPIPETTA E DEPOSTO DELICATAMENTE NEL POZZETTO, FACENDO ATTENZIONE A NON BUCARNE IL FONDO NÉ A INTRODURRE BOLLE D’ARIA CHE POTREBBERO COMPROMETTERE LA CORSA.
UN ESEMPIO CLASSICO È IL BROMURO DI ETIDIO, CHE INTERCALANDOSI TRA LE BASI DEL DNA EMETTE FLUORESCENZA QUANDO È ILLUMINATO DA LUCE ULTRAVIOLETTA.
QUESTO CONTIENE SOSTANZE CHE AUMENTANO LA DENSITÀ DEL CAMPIONE, COME IL GLICEROLO, IN MODO CHE IL LIQUIDO AFFONDI NEL POZZETTO SENZA DISPERDERSI,
E INCLUDE DEI COLORANTI CHE PERMETTONO DI SEGUIRE VISIVAMENTE IL MOVIMENTO DEL FRONTE DI MIGRAZIONE DURANTE L’ELETTROFORESI.
IL GEL COLORATO VIENE POSTO SU UN TRANSILLUMINATORE, CIOÈ UNA PIATTAFORMA CHE EMETTE LUCE UV O BLU, A SECONDA DEL COLORANTE UTILIZZATO.
PER POTER ESSERE CARICATI CORRETTAMENTE, I CAMPIONI VENGONO MISCELATI CON UN APPOSITO BUFFER DI CARICAMENTO.
QUANDO LA LUCE COLPISCE IL DNA LEGATO AL COLORANTE, SI PRODUCE FLUORESCENZA, E COSÌ LE BANDE DI DNA DIVENTANO VISIBILI COME STRISCE LUMINOSE.
QUANDO SI PARLA DI CARICAMENTO DEI CAMPIONI SU GEL DI AGAROSIO, CI SI RIFERISCE AL MOMENTO IN CUI I PRODOTTI DI UNA PCR VENGONO INTRODOTTI NEI PICCOLI POZZETTI RICAVATI NEL GEL, CHE SI TROVA IMMERSO NEL TAMPONE DI CORSA