Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
DIGITAL PCR (dPCR), 2.Solid based โดยเครื่อง QuantStudio Absolute Q…
DIGITAL PCR (dPCR)
dPCR อ่านค่าสัญญาณ Fluorescent หลังจากปฏิกิริยาสามารถที่จะสิ้นสุดลง เป็นหลักการที่จะช่วยกระจายโมเลกุลเข้าไปในช่อง เกิด PCR reaction เกิดขึ้น ผลสุดท้ายจะเห็นว่าช่องเป็น Positive หรือ Negative
หัวใจสำคัญของเครื่อง PCR
- Microfluidic Array Plate (MAP) Technology
ใช้ในการกระจายโมเลกุล 1 plate ได้สูงสุดถึง 16 ตัวอย่าง มี Micro-chamber ระกอบไปด้วยมากถึง 20,480 ในแต่ละ Micro-chamber ประกอบไปด้วย 432 pL
ในการเตรียมปฏิกิริยา dPCR คล้ายกับ Real-Time PCR
การเตรียม 1.dPCR Mastermix 2.Probe/Primer 3.DNA/RNA template
Micro-chamber
คือ ประกอบไปด้วยมากถึง 20,480 ช่องที่ดูว่า ถ้าเกิดเป็น Negative = นับเป็น 0 ถ้าเกิดเป็น Positive = ช่องที่มีตัวอย่างที่เราสนใจ
การกระจายโมเลกุลลงไปในแต่ละช่อง Ideal situation = 1 ช่อง ควรจะมี 1 Target Reality= 1 ช่อง อาจมีได้หลาย Target
-
ในปฏิกริยาจะมี - Target of interest - Non-target - Impurities/Inhibitors ซึ่ง Non-target และ Impurities/Inhibitors จะมีการบดบังทำให้ Real-Time PCR ไม่สามารถเพิ่มปริมาณ DNA ที่มีขนาดน้อยได้ แต่เนื่องจาก dPCR การที่กระจายโมเลกุลไปแต่ละช่องเป็นการเจือจาง พวก Non-target และ Inhibitors จึงทำให้ dPCR ทนทานต่อ PCR inhibitor
-
หลักการ Digital PCR
1. Sample dilution and PCR reaction mix setup ต้องเจือจางตัวอย่าง ถ้าไม่เจือจาง ผลจะเป็นบวกจนหมด ทำให้มีความแปรปรวนเกิดขึ้น ค่าที่ได้จะไม่แน่นอน
-
ข้อดี
-
- Highly sensitive ตรวจวัดหา DNA ในปริมารน้อยได้
- ไม่ต้องใช้ Standard curve
- ทนทานต่อการเกิด PCR inhibitors
-
การประยุกต์ใช้ PCR
1.ตรวจสอบคุณภาพด้านอาหาร 2.การบำบัดเซลล์และยีน 3.การทดสอบความปลอดภัยของอาหาร 4.การเฝ้าระวังสิ่งแวดล้อม 5.การวิจัย Translational Genomics 6.โรคติดเชื้อ 7.เกษตรกรรม
เช่น น้ำเสียจะมีสิ่งปฏิกูลอยู่ พวกไวรัสและแบคทีเรีย อาจทำให้เกิดการป่วย จะใช้ PCR มาทดสอบทำได้ง่าย โดยใช้น้ำยาในการตรวจน้ำเสีย คือ Absolute Q 1-step RT-dPCR Master Mix (4K)
-
- auto false-positive rejection AI คอยจับตาดูว่าในแต่ละ Micro-chamber มีสัญญาณเรืองแสงที่ผิดปกติหรือไม่ คัดกรองผล PCR ลวง ออกไป
-
-
-
-
-
-
