Please enable JavaScript.

Coggle requires JavaScript to display documents.

Digital PCR, คือการพัฒนาการของเทคนิค PCR, การทำ PCR แบบดั้งเดิม → ใช้…

- - - - Primer against target of interest
        
        DNA polymerase & Master Mix
        
        Thermal cycler
    - - Annealing (50–65°C)
        
        Extension (72°C)
    - - Laborious operation
        
        • Single application (qualitative)
  - - - Primers
        
        dNTPs
        
        DNA Polymerase
        
        Fluorescent Dye/Probe
    - - อุณหภูมิจะเพิ่มสูงขึ้นไปที่ประมาณ 95°C เพื่อทำลายพันธะไฮโดรเจนที่ยึดสายดีเอ็นเอคู่ให้แยกออกจากกัน กลายเป็นสายเดี่ยว
      - การจับของไพรเมอร์ (Annealing)
        
        อุณหภูมิจะลดลงไปที่ประมาณ 50-65°C เพื่อให้ไพรเมอร์สามารถเข้าจับกับลำดับดีเอ็นเอแม่แบบที่เป็นสายเดี่ยวได้อย่างจำเพาะเจาะจง
        
        การสังเคราะห์สายใหม่ (Extension)
        
        อุณหภูมิจะเพิ่มขึ้นไปที่ประมาณ 72°C ซึ่งเป็นอุณหภูมิที่เหมาะสมสำหรับเอนไซม์ DNA Polymerase ที่จะเริ่มสังเคราะห์ดีเอ็นเอสายใหม่ โดยใช้ดีเอ็นเอแม่แบบเป็นต้นแบบ
        
        ในขั้นตอนนี้ สารเรืองแสงจะเริ่มทำงาน:
        
        ถ้าใช้สารย้อมที่จับกับดีเอ็นเอคู่ (เช่น SYBR Green): สารนี้จะไปจับกับดีเอ็นเอสายคู่ที่ถูกสร้างขึ้นใหม่ และปล่อยสัญญาณเรืองแสงออกมา ซึ่งความเข้มของแสงจะเพิ่มขึ้นตามปริมาณดีเอ็นเอที่เพิ่มขึ้นในแต่ละรอบ
        
        ถ้าใช้โพรบ (Probe): โพรบจะเข้าจับกับลำดับภายในของดีเอ็นเอเป้าหมาย เมื่อเอนไซม์ DNA Polymerase สังเคราะห์สายดีเอ็นเอผ่านบริเวณนั้น จะทำให้สารเรืองแสงบนโพรบถูกตัดขาดออกจากส่วนที่ยับยั้งการเรืองแสง ส่งผลให้เกิดสัญญาณเรืองแสงขึ้น
    - - เครื่องจะบันทึกค่าการเรืองแสงในทุกๆ รอบปฏิกิริยา โดยจะแสดงผลในรูปกราฟการเพิ่มขึ้นของค่าเรืองแสง (amplification curve)
        
        ค่า Ct (Cycle threshold)
        
        ยิ่งค่า Ct ต่ำ แสดงว่าปริมาณสารตั้งต้นในตัวอย่างมีมาก ยิ่งค่า Ct สูง แสดงว่ามีปริมาณสารตั้งต้นน้อย
        
        การคำนวณ
        
        ใช้ค่า Ct ที่ได้มาเปรียบเทียบกับกราฟมาตรฐาน (Standard Curve)
  - - - Compartmentalization (การแบ่งปฏิกิริยา)
        
        PCR amplification
        
        Post-PCR counting
        
        ใช้ Poisson distribution เพื่อคำนวณหาจำนวนสำเนาของ DNA/RNA เป้าหมาย
        
        ตรวจว่าแต่ละช่องเป็น Positive (มี target) หรือ Negative (ไม่มี target)
        
        กิดการจำลอง DNA ในแต่ละช่องเล็ก (independent reactions)
        
        แบ่ง reaction เดียวออกเป็นหลายพัน–หมื่นช่องเล็ก (microchambers หรือ droplets)
      - template, primers/probes, master mix
    - - Reference material is often not readily available or easy to generate.
        
        Orthogonal testing of reference material is recommended to confirm the
        concentration of reference material
        
        Generation of high-quality standard curves is somewhat laborious, expensive,
        and requires some technical expertise
        
        If not analyzed properly, standard curve data can be misleading or
        misinterpreted.
        
        Real-time PCR may not yield acceptable precision or reproducibility.
    - - Sample dilution and PCR reaction mix setup
        
        Partitioning of PCR reaction
        
        Amplification of partitioned PCR reaction
        
        Readout and quantification
- - - - Highly sensitive
        
        Need Standard curve for absolute quantification
        
        Data cannot be compared between labs (Ct
        values)
        
        Probable PCR inhibition
  - - - Highly sensitive, particularly for low
        concentration samples
        
        Standard curve free quantification (reduces
        variability)
        
        Data can be compared between labs
        (copies/uL)
        
        Improved tolerance to some PCR inhibitors