Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
Digital PCR - Coggle Diagram
Digital PCR
เปรียบเทียบ Real-Time PCR กับ Digital PCR
(Real-Time PCR compared to digital PCR)
Real-time PCR
ค่อนข้างน้ำไปใช้กันอย่างกว้างขวาง
Highly sensitive
จำเป็นต้องใช้ Standard curve สำหรับวิเคราะห์แบบ absolute quantification
ยังทำให้เกิด PCR Inhibitions อยู่บ้างเมื่อเทียบกับ Conventional PCR
Digital PCR
ปัจจุบันมีการนำมาใช้อย่างกว้างขวาง
Highly sensitive, สามารถตรวจวัดหาตัวอยาา
ที่เป็น DNA เป้าหมายปริมาณน้อยได้
ไม่ต้องใช้ Standard curve
ทนทานต่อการเกิด PCR Inhibitions
วิวัฒนาการ PCR
(Evolution of PCR)
First Generation (Conventional PCR)
ลักษณะที่สำคัญ
เห็นผลได้ ณ จุดสิ้นสุด
(เห็นผลได้หลังจากที่ปฏิกิริยาเสร็จสมบูรณ์แล้ว
ผลที่ได้ออกมาจะเป็น Semi-quantitative (Yes/No)
ความแม่นยำขึ้นอยู่กับหลายปัจจัย (Highly variable)
ไวต่อสารยับยั้ง PCR (Sensitive to PCR inhibitors)
สิ่งที่ต้องการได้รับจาก Conventional PCR
เพิ่มปริมาณ DNA เป้าหมาย ให้มีปริมาณมากพอที่จะสามารถนำไปใช้ในงานวิจัยได้
เพิ่มปริมาณ DNA เป้าหมายเพื่อดูว่ามีหรือไม่มีในตัวอย่างที่สนใจ
องค์ประกอบในการทำ Conventional PCR
Template (ตัวตั้งต้นที่ใช้เพิ่มปริมาณ DNA)
Primer (Primerทำหน้าที่จับกับ DNA Template)
DNA polymerase (เอนไซม์ช่วยในการสังเคราะห์ DNA สายใหม่) & Master Mix
Thermal cycler (ปฏิกิริยาจะไม่สามารถเกิดขึ้นได้ถ้าไม่มีเครื่อง Thermal cycler)
ในการทำปฏิกิริยาของเครื่อง Thermal cycler
มี 3 ขั้นตอน
Denaturation (ใช้อุณหมิสูงไปถึง 95 องศาเซลเซียส ในการแยก DNA สายคู่เป็น DNA สายเดี่ยว)
Annealing (ลดอุณหมิให้เหมาะสมกับตัว Primer เพื่อให้Primer ไปจับกับบริเวณที่สนใจ)
Extension (มีเอนไซม์ DNA polymerase ทำหน้าที่สังเคราะห์ DNA สายใหม่เกิดขึ้น)
สิ่งที่ได้
หลังจากที่ได้ PCR Product ที่มากเพียงพอแล้วจะนำมาแยกขนาด DNA -> โดยใช้เครื่อง Gel eletrophoresis (เป็นเครื่องที่ใช้ในหลักการกระแสไฟฟ้าในการแยกขนาด DNA , DNA ขนาดเล็กเคลื่อนที่ไวกว่าขนาดใหญ่) ->จะมองเห็น band ได้ต้องใช้เครื่อง UVP
ข้อจำกัด
ถ้าตัวอย่างมีปริมาณของ DNA เป้าหมายที่สนใจน้อยมากๆ Conventional PCR อาจไม่สามารถเพิ่มปริมาณสิ่งที่สนใจได้
ใช้เวลาในการทำค่อนข้างนานมากๆ
ผลที่ได้จะได้แค่ Semi-quantitative จะบอกได้แค่มีกับไม่มีในตัวอย่างที่สนใจ
ดูขนาดความใหญ่ของ band ได้แต่ไม่สามารถบอกได้ว่า DNA เป้าหมายที่สนใจมีปริมาณที่สนใจอยู่เท่าไหร่
Second Generation
(Real-Time PCR)
ลักษณะที่สำคัญ
Real-Time PCR ถูกพัฒนาขึ้นมาเพื่อสามารถนำไปใช้ในข้อบกพร่องของ Conventional PCR
ผลที่ได้จาก Real-Time PCR จะได้ผลใน Relative quantification
Absolute quantification ต้องมีการใช้ Standard Curves
ไวต่อสารยับยั้ง PCR น้อยกว่า Conventional PCR(Sensitive to PCR inhibitors)
Highly variable (particularly at higher Ct)
หลักการติดตาม Real-time PCR
Real-time PCR สามารถติดตาม DNA เป้าหมายแบบ Real-timeได้
สามารถดูผลได้จากสัญญาณเรืองแสงที่เพิ่มขึ้นได้ในแต่ละรอบ(Fluorescence)
ระบบการตรวจวัดของ Real-time PCR มี2ระบบ
Non-specific binding dye
(SYBR Green)
Denaturation
ในปกติน้ำยา SYBR Green ที่มีอยู่ในสารละลายมีการให้สัญญาณเรืองแสง(Fluorescence)ในลักษณะต่ำ
Annealing & Extension
เมื่อเข้าสู่กระบวนการ Annealing & Extensionจะมีการเกิด DNA สายคู่เกิดขึ้น น้ำยา SYBR Green จะเข้าไปจับกับบริเวณที่เป็น DNA สายคู่
Reaction completion
ทำให้เกิดสัญญาณการเรืองแสงเพิ่มมากขึ้น
ลักษณะของ SYBR Green ที่มีการไปจับกับบริเวณที่เป็น DNAสายคู่สามารถที่จะไปจับกับส่วนที่สนใจหรือไม่สนใจก็ได้ที่มีการ Amplify เกิดขึ้นดังนั้นจึงต้องมีการใช้
(Melt Curve)
เข้ามาช่วย เพื่อช่วนในการจำแนกว่าสัญญาณอันไหนที่เกิดขึ้นเป็นสัญญาณเรืองแสงของตัว target ที่สนใจ
Probe detection
มีความจำเพาะเจาะจงมากกว่า SYBR Green
หลักการ
มี Reporter (5’) Quencher (3’) Extension จะมีEnzyme DNA polymerase เพื่อช่วยเพิ่มลำดับนิวคลีโอไทด์เข้าไปทำให้ตัว Reporterหลุดออกจากตัว Quencher จะทำให้เกิดสัญญาณการเรืองแสงเกิดขึ้น
ไม่จำเป็นต้องใช้ Melt Curve
ถ้าต้องการหา Target หลายๆ Target ในปฏิกิริยาเดียวกันสามารถออกแบบ Probeให้ติดสีแตกต่างกันได้
การทำงานรวดเร็ว
ลักษะการติดตามการเพิ่มจำนวนDNAเป้าหมาย แบบ Real-time PCR
ระยะแรกหรือ Baseline มีการเพิ่มปริมาณของ DNA ที่สนใจอยู่ในปริมาณที่ต่ำ (สัญญาณการเรืองแสงที่เกิดขึ้นจะไม่สูงมาก)
เข้าสู่ Exponential phase การเพิ่มปริมาณ DNA เป้าหมายจะเยอะมาก (สัญญาณการเรืองแสงที่เกิดขึ้นจะสูงมาก)
เมื่อสารตั้งต้นใช้งานหมดแล้วจะเข้าสู่จุดอิ่มตัว
เส้นสีแดง ไม่มีสัญญาณการเรืองแสงเกิดขึ้นเลย หมายความว่าในตัวอย่างไม่มี DNA ที่สนใจอยู่
-การหาค่า Ct สามารถลากเส้นมาตัดจุดแกน X
ทำหลายๆตัวอย่างในกราฟเดียวกัน (Ctต่ำ ตัวอย่าง DNA เป้าหมายที่สนใจสูง,Ctสูงตัวอย่าง DNA เป้าหมายที่สนใจต่ำ)
การคำนวณที่ได้ผลแบบ Absolute quantification ต้องใช้ Standard Curves
Standard Curves ต้องทราบความเข้มข้นที่แน่นอน เริ่มต้นด้วยการทำ dilution
เมื่อเข้าสู่การทำ Real-time PCR เมื่อมีตัวอย่างที่ไม่ทราบค่าความเข้มข้นเมื่อเปรียบเทียบกับ Standard จะสามารถคำนวณค่าความเข้มข้นได้
การทำ Standard Curve มีข้อจำกัด
DNA ตั้งต้นที่ทราบความเข้มข้นที่แน่นอนสำหรับงานวิจัยบางครั้งอาจมีการหา DNA อันนั้นยาก อาจเป็นจุดเริ่มต้นปัญหาในการทำงานวิจัย
plasmid ที่นำมาใช้เป็น Standard Curve ต้องตรวจสอบความถูกต้องอย่างแม่นยำก่อน ไม่นั้นผลที่ได้ออกมาอาจมีความคลาดเคลื่อน
การทำ Standard Curve ต้องมีการใช้ผู้เชี่ยวชาญเนื่องจากการทำ dilution ต้องมีความแม่นยำทางด้านปิเปต ถ้ามีความerror ทางปิเปตหรือมีการเตรียมปฏิกิริยาผิด ผลที่ได้ก็จะความคลาดเคลื่อน
Real-Time PCR and Technical Replicates
การทำงานวิจัยโดยใช้ Real-time PCR ต้องมีการทำซ้ำเกิดขึ้น 2-3ครั้ง
สมมติใน1ตัวอย่างมี การทำซ้ำ3ครั้ง สัญญาณการเรืองแสงที่เกิดขึ้นต้องซ้อนทับกันเพื่อบ่งบอกว่าค่าที่เราได้มีความแม่นยำ
ในกรณีที่ตัวอย่างมีปริมาณ DNA เป้าหมายน้อยมากๆ 1ตัวอย่าง ทำซ้ำ3ครั้ง ค่าCt ที่ได้จะค่อนข้างสูงและสัญญาณการเรืองแสงที่เกิดขึ้นจะไม่ซ้อนทับกัน (ผลที่ได้จะไม่มีความแม่นยำ) จึงเป็นที่มาของการพัฒนา เป็น Third Generation
Third Generation (Digital PCR)
ลักษณะที่สำคัญ
การได้ผลแบบ Absolute quantification ไม่ต้องมีการใช้ Standard Curves
ทนทานต่อ PCR inhibitors
การวิเคราะห์ผลรวดเร็ว
Digital PCR คืออะไร (What is digital PCR?)
What is Digital PCR?
เครื่อง Digital PCR สามารถอ่านค่า สัญญาณ Fluorescence หลังจากปฏิกิริยาสิ้นสุดลง
หลักการ
กระจายโมเลกุลเข้าไปในแต่ละช่องเล็กๆ โดยเกิดเป็น PCR reaction เกิดขึ้น
สุดท้ายจะสามารถเห็นได้ว่า ช่องไหนมีจำนวนPositive จะนับ =1 ที่ต้องการ หรือ Negative จะนับ =0
การเตรียมปฏิกิริยา Digital PCR
จะมีลักษณะคล้ายกับ Real-Time PCR
โดยจะเริ่มต้นที่
dPCR Mastermix
Probe/Primer
DNA/RNA template
ถ้ามีการใช้ Real-Time PCR มีตัว Probe/Primer อยู่แล้วสามารถนำมาประยุกต์ใช้กับเครื่อง Digital PCR ต่อได้
ปฏิกิริยาที่เตรียมเสร็จเรียบร้อยแล้ว จะถูกกระจายโมเลกุลเข้สไปอยู่ในแต่ละช่อง ในแต่ละช่องเรียก “ Micro-chambers”
ซึ่งแตาละช่อง Micro-chambers จะถูกปฏิกิริยา dPCR ดำเนินต่อไปผลสุดท้ายจะเห็นช่องไหนไหนมีตัวอย่างที่สนใจ จะนับเป็น Positive =1
ช่องไหน Negative นับเป็น = 0
ตัวปฏิกิริยา
จะมี Target of interest , Non-target , Impurities/Inhibitors
ในกรณี Real-Time PCR พวก Non-target , Inhibitors จะมีการบดบังเกิดขึ้น ความบดบังอาจทำให้ วิธีการของReal-Time PCR ไม่สามารถเพิ่มปริมาณ DNA ที่มีอยู่ปริมาณน้อยได้
Digital PCR การกระจายโมเลกุลเข้าไปสู่แต่ละช่องเหมือนเป็นการเจือจาง Non-target , Inhibitors ลดไปได้ด้วย (จึงเป็นที่มาว่าทำไมเครื่องDigital PCR ถึงทนทานต่อ PCR Inhibitors ได้)
การกระจายโมเลกุลลงไปในแต่ละช่อง
หลักการ Ideal situation
1 ช่อง : 1 Target of interest 1 Non-target
Reality (ในความเป็นจริง)
1 ช่อง :อาจมีตัว Target of interest หรือ Non-target กระจายโมเลกุลเข้าไปสู่ในแต่ละช่องเป็นลักษณะการกระจายแบบสุ่มเกิดขึ้น
Statที่นำมาใช้ในการคำนวณเป็น Statการแจกแจงแบบ Poisson’s law สามารถให้ทราบข้อมูลได้เลยว่าตัวตั้งต้นมีปริมาณที่เราต้องการอยู่ copies/ul เท่าไหร่
หลักการ Digital PCR
ต้อง dilution ตัวอย่างก่อนสำหรับการทำปฏิกิริยา ถ้าไม่ dilution ตัวอย่างอาจทำให้ทุกช่องเกิดเป็นผล + จนหมด ซึ่งอาจทำให้เกิดความแปรปรวนเกิดขึ้น ค่าที่ได้ไม่แม่นยำ
การทำการ dilution จะทำให้ทุกช่องมีส่วนที่เป็น Positive,Negative การคำนวณจะได้ผลที่แม่นยำมากขึ้น
หลักการ Partitioning of PCR reaction มี 2 หลักการ
2.1 Liquid based generation (Droplet)
2.2 Solid based generation
โมเลกุลแยกเป็นแต่ละช่องเกิดเป็นปฏิกิริยาเกิดขึ้น
ผลที่ได้จะได้เป็น Positive and negative
Positive reaction : จุดสีน้ำเงินเล็กๆเกิดขึ้น
เมื่อไหร่ที่ควรใช้เครื่อง Digital PCR
ต้องการทำตัวอย่างที่เป็น rare target มากๆ
มีปริมาณ DNA เป้าหมายน้อยมากๆ
ไม่ต้องการทำ standard curves
ตัวอย่างที่มีความซับซ้อนมาก (e.g. liquid biopsy, environmental samples, CRISPR) จะมี PCR Inhibitors อยู่แล้วจะสามารถใช้ Digital PCR ได้อย่างง่ายมากขึ้น
คุณสมบัติตัวเครื่อง QuantStudio TM Absolute Q TM
ตัวเครื่องจะมีตั้งแต่ การแยกโมเลกุลในแต่ละช่อง การเกิด PCR เกิดขึ้น รวมไปถึงการวิเคราะห์ผลจะเกิดขึ้นภายในเครื่องเดียวเท่านั้น
มีซอฟแวร์ช่วยในการเปิดปิดเพื่อโหลดตัวอย่างเข้าไปได้
ทำงานสูงสุดได้ถึง 4 Target (ข้อดีคือถ้าต้องการตรวจวัดหลาย Target ในตัวเดียวกันสามารถออกแบบProbeให้ติดสีแตกต่างกันได้), Sensitivity
1–100,000 copies
รันตัวอย่าง1ครั้งรันได้สูงสุดถึง16ตัวอย่าง
Micro-chambers ประกอบไปด้วย 20,480 ช่วยลดความแปรปรวน ผลที่ได้ค่อนข้างแม่นยำ ในแต่ละ Micro-chambers ประกอบไปด้วย 432 pL
สูญเสียตัวปฏิกิริยาไปแค่ 5% (มีปฏิกิริยามากถึง95%)
หัวใจสำคัญชอบ Digital PCR คือหลักการ Microfluidic Array Plate (MAP)
ใช้ในการกระจายโมเลกุลลงไปสู่ในแต่ละ Micro-chambers
ยังมีเทคโนยี auto false-positive
มีตัวAI จับดูว่าในแต่ละ Micro-chambers มีสัญญาณการเรืองแสงที่ผิดปกติหรือไม่?
คัดกรองผลPCRลวงออกไปด้วย
ขั้นตอนการทำ Digital PCR ของ เครื่อง QuantStudio TM Absolute Q TM มี4ขั้นตอน
เตรียม reaction
โหลดตัวอย่างลงบน MAT plate
เข้าสู่การรันเครื่อง
วิเคราะห์ผล
น้ำยาที่เป็นผลิตภัณฑ์ของ Apple biosystem
Absolute Q 1-step RT-dPCR Master Mix (4X) ถูกพัฒนาให้มีความไวต่อการทำงาน มีการใช้ตั้งแต่ตัวอย่าง RNA -> cDNA แล้วทำปฏิกิริยาของ Digital เกิดขึ้นภายในปฏิกิริยาเดียว ลดการปนเปื้อนของตัวอย่าง
Absolute Q DNA Digital Master Max (5X) น้ำยาสำหรับตัวอย่าง DNA
QuantStudio Absolute Q MAP16 Plate kit Plastic ที่ใช้กับตัวเครื่อง Digital PCR
น้ำยาสำเร็วรูป ยกตัวอย่าง 2 แบบ
น้ำยาตรวจวัดไวรัส สำหรับ target AAV หรือ CMV
น้ำยาที่เหมาะกับทำตัวอย่างที่เป็น liquid biopsy หรือใช้หาตัวมะเร็งที่เกิดขึ้น Gene BRAF,EGFR นำไปใช้ในพวก Clinical จำนวนมากเพราะให้ผลแม่นยำใช้เวลาไม่นาน
ออกแบบน้ำยาเอง
ผ่านเว็บ
https://www.thermofisher.com/th/en/home/life-science/pcr/digital-pcr/mutation-detection.html
เครื่อง Digital PCR สามารถนำไปประยุกต์ใช้งานทางด้านไหนได้บ้าง
(dPCR Applications Overview)
Precision Medicine
Food Safety Testing (การตรวจสอบคุณภาพทางด้านอาหาร)
Translational Genomics Research
Infectious Diseases
Agriculture
Environmental Surveillance
Cell & Gene Therapy
นำไปประยุกต์ใช้ทางด้านสิ่งแวดล้อม
ตัวอย่าง ทางด้านน้ำเสีย
น้ำเสียมีการปนเปื้อนของสิ่งปฏิกูลเกิดขึ้น โดยสิ่งปฏิกูลอาจมีเชื้อไวรัส เชื้อแบคทีเรีย ปนเปื้อนอยู่ ซึ่งทำให้เกิดการเจ็บป่วย เสียชีวิตจำนวนมาก ดังนั้นสามารถใช้เทคโนโลยี PCR เข้ามาช่วยได้
เช่นใช้น้ำยา Absolute QTM dPCR SARS-CoV-2 Wastewater Surveillance Kit ภายใต้ Apple bio system ตรวจวัดไวรัสจากตัวอย่างน้ำเสียที่เกิดขึ้น
ตรวจสอบคุณภาพทางด้านอาหาร (Food Safety Testing)
บางครั้งอาจมีการปนเปื้อนของ แบคทีเรีย , ยาฆ่าแมลงที่ปนเปื้อนมาในกระบวนการผลิต