Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
COVID&RealtimePCR, Note : Angiotensin converting enzyme (ACE2) จับกับ…
COVID&RealtimePCR
Coronavirus structure
โปรตีน S เป็นโปรตีนที่ยื่นออกมาจากเปลือกนอก (envelope) ของอนุภาคไวรัสมีลักษณะคล้ายมงกุฎและสำคัญต่อการก่อโรคในคน
-
-
COVID-19
การแสดงอาการของผู้ป่วย
- หายใจลำบาก ไอแห้ง ไอมีเสมหะ มีไข้
- ปวดกล้ามเนื้อหรือปวดข้อ ปวดศรีษะ
- อาจมีอาการทางระบบทางเดินอาหาร เช่น ท้องเสีย
การเก็บตัวอย่าง
-
ผู้ป่วยที่มีอาการรุนแรง ปอดบวม ปอดอักเสบเก็บตัวอย่างจากระบบทางเดินหายใจส่วนกลาง Bronchoalveolar lavage (BAL) , tracheal aspirate , sputum ห้ใส่ภาชนะปลอเชื้อ ไม่ต้องใส่ UTM/VTM
ผู้ป่วยที่มีอาการอุจจาระร่วง เก็บอุจจาระ 10-20 ml sinv 5-10 g ใส่ในภาชนะปลอดเชื้อ ต้องแช่ในกระติกน้ำแข็งทันที หรือ 4-8 องศา แล้วส่งห้อง LAB ภายใน 24 ชม. (ถ้าไม่ทันทีให้เก็บ -70 องศา
-
Concept Real Time PCR
หลักการหลักๆเหมือน PCR เพียงแต่เพิ่มเทคนิคการใช้สารเปล่งแสง ในการตรวจสอบปริมาณ DNA ที่สนใจได้ในระหว่างการทำปฏิกิริยา ทำให้สามารถตรวจสอบได้แบบ Real Time
-
Work flow
-
Real-Time PCR
เก็บตัวอย่าง (Sample collection)
ทำให้ตัวอย่างเป็นเนื้อเดียวกัน (Homogenization)
สกัดและทำให้ DNA บริสุทธิ์ (DNA extraction and purification)
วัดปริมาณ DNA (DNA quantification)
เตรียมปฏิกิริยา PCR (PCR reaction setup)
ขยาย DNA และตรวจวัดพร้อมกัน (DNA amplification + Detection)
การตรวจหา COVID-19
Open Reading Frame (ORF)1a และ ORF1b
ทำหน้าที่สร้าง non-structural protein อย่างน้อย 16 ชนิด
มีคุณสมบัติเป็นเอนไซม์เกี่ยวข้องกับ
- การจำลองสาย DNA ใหม่ (RNA replication)
- การเกิด RNA replication
- การเพิ่มจำนวนไวรัสภายในเชื้อที่ติดเชื้อ
วิธีการวินิจฉัยระดับโมเลกุล
- Real Time PCR (ตรวจ ORF1b หรือ N gene
- Nucleotide sequencing (ตรวจสอบลำดับเบสของ ORF1b หรือ N gene)
Real-time PCR work
Amplification plot (3 phase)
1.inital phase : ช่วงที่แสง Fluorescence ต่ำกว่าที่เครื่องจะตรวจวัดได้
- Exponential phase : ช่วงที่ FR เพิ่มขึ้นเป็น Exponential
- Plateau phase : เป็นช่วงที่ FR เริ่มคงที่
Threshold & Ct Value
- Threshold = เส้นตรงที่ลากขนานกับแกนจน. รอบของการทำงานของ real-time PCR บนกราฟซึ่งเป็นเส้นที่อยู่เหนือเส้น baseline
- Ct (cycle threshold) values = ค่าจน.รอบของการทำงานของ real-time PCR ที่ทำให้ FR ตัดกับเส้นThreshold เป็นค่าที่บ่งชี้ความเข้มข้นของเชื้อ ที่ทดสอบ
มีความสัมพันธ์แบบผกผันกับความเข้มข้นเชื้อ
Concept PCR
พื้นฐาน PCR
เป็นเทคนิคหรือวิธการเพิ่มปริมาณ DNA ที่สนใจในการทดลอง อาศัยการทำงานของ Enzyme Taq Polymerse และการเพิ่มขึ้นลงของอุณหภูมิอย่างมีรูปแบบหลายๆรอบ
-
- Denaturation > ขั้นตอนการแยกสาย DNA สายคู่ไปเป็นสายเดี่ยว โดยใช้อุณหภูมิที่สูง 94-98 องศา
- Annealing ขั้นตอนที่ Primer จะเข้ามาเกาะ DNA สายเดี่ยว Primer 1คู่ : Forword Reword อุณหภูมิ 37-65 องศา
- Sythesizing ขั้นตอนการสังเคราะห์ DNA สายใหม่ ด้วย Enzyme Taq Polymerse อุณหภูมิ 72 องศา
-
BAL เป็นเทคนิคการนำน้ำเกลือ/normal saline ฉีดลงในทางเดินอาหารส่วนล่างและดูดกลับคืนในระยะเวลาสั้นๆ > Cell และสารต่างๆจากถุงลมและหลอดลมส่วนปลาย
VTM = penicillin , sttreptomycin , gentamycin/amphotericinB , fungizone
(ควรเก็บที่ 4 องศา)
UTM = vancomycin และ colistin
(เก็บที่ Room temperature)
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
