Please enable JavaScript.

Coggle requires JavaScript to display documents.

COVID19&Real-time PCR, นางสาว ชนาพร ช่วยทอง 66040730071 - Coggle…

- - - - แยก DNA สายคู่ให้เป็น DNA สายเดี่ยว โดยใช้อุณหภูมิสูง ประมาณ 94-95 องศาเซลเซียส
    - - primer เข้ามาเกาะกับ DNA สายเดี่ยว โดยลดอุณหภูมิลง ประมาณ 37-65 องศาเซลเซียส
        
        primer มี 1 คู่ ได้แก่ forward จับบริเวณ 5’ และ reverse จับบริเวณ 3’
    - - สังเคราะห์ DNA สายใหม่ด้วย Taq polymerase ที่อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส
  - - - Homogenization
        
        DNA extraction and purification
        
        DNA quantification
        
        PCR reaction setup
        
        DNA amplification ที่มี Detection
- - - - สกัด RNA ของ SARS-CoV-2 !! RNA สลายง่าย ต้องทำเเบบ RNase-free!!
      - DNA quantification
        
        ตรวจคุณภาพเเละปริมาณ RNA ด้วย spectrophotometer OD280
        
        Reverse transcriptase
        
        เปลี่ยน RNA ให้เป็น cDNA ด้วย reverse transcriptase
        
        ได้ cDNA เป็น template สำหรับ PCR
        
        PCR reaction setup
        
        เตรียมหลอด PCR ภายในหลอดจะมี cDNA template, primer เฉพาะยีนเป้าหมาย (ORF1a , ORF1b), Fluorecent dry (SYBR green, TaqMan), dNTPmix, buffer, Taq DNA polymerase
        
        DNA amplification ที่มี Detection
        
        รันเครื่อง Real-time PCR ซึ่ง 1 cycle มี 3 ขั้นตอน 1. Deneturation 2. Annealing 3. Extensios ทำ 30-40 cycle
        
        ตรวจวัด intensity ของ fluorescent ทุกcycle ได้กราฟ amplification plot 3 ช่วง ได้แก่
        1.initial phase : แสง Fluorescence ต่ำกว่าที่เครื่องจะตรวจวัดได้
        2.exponential phase : ช่วง FR เพิ้มขึ้นเป็น exponential
        3.plateau phase : ช่วง FR เริ่มคงที่
        
        ตีความผล (Ct value)
        
        Ct vlues : คำจำนวนรอบของการทำงานของ Real-time PCR ที่ให้ FR ตักกับเส้น Threshold บ่งชี้ความเข้มข้นของเชื้อที่ค้องการตรวจทดสอบโดยมีความสัมพันธ์เเบบผกผันกับความเข้มข้นเชื้อ
        
        ค่ามากเชื้อน้อย ค่าน้อยเชื้อมาก
        
        Threshold เส้นตรงที่ขนานกับแกนจำรอบการทำงานของ Real-time PCR บนกราฟซึ่งเป็นเส้นที่อยู่เหนือเส้น baseline