Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
How to detect for COVID-19 disease with Real-time PCR technique - Coggle…
How to detect for COVID-19 disease with Real-time PCR technique
PCR reaction
PCR เป็นเทคนิค หรือ วิธีการเพิ่มปริมาณDNAของยีนส์ที่สนใจในหลอดทดลอง (Invitro)
PCR มี3ขั้นตอน
Denaturation : การแยก DNA สายคู่เป็น DNA
สายเดี่ยว โดยใช้อุณหภูมิที่สูง 94-95 องศาเซลเซียส
Annealing : Primersจะเข้ามาเกาะกับ DNA สายเดี่ยว Primers ในหลอดทดลองมี1คู่2เส้น คือ Forward PrimerกับReverse Primer ด้วยอุณหภูมิที่ลดลงประมาณ 37-65 องศาเซลเซียส
Synthesizing : การสังเคราะห์ DNA สายใหม่ด้วย enzyme “Tap polymerase” ด้วยอุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส
Concept (PCR & Real time PCR)
CONVENTIONAL PCR
เป็นการเพิ่มปริมาณDNAของยีนส์ที่เราสนใจในหลอดทดลองให้ได้ปริมาณมากพอที่จะสามารถทำการตรวจสอบได้
อาศัยการทำงานของ Enzyme Taq DNA polymerase และการเพิ่มขึ้นลงของอุณหภูมิ
ไม่มีสารสีเปล่งแสง(Fluorescent)ในระหว่างการทำปฏิกิริยา
REAL TIME PCR
หลักการหลักๆเหมือนกับ PCR
สิ่งที่แตกต่างคือ เพิ่มเทคนิคการใช้สารสีเปล่งแสง(Fluorescent) ในการตรวจสอบปริมาณ DNA ที่สนใจ ได้ในระหว่างการเกิดปฏิกิริยา
สามารถตรวจสอบได้แบบ real time (ตรวจสอบปฏิกิริยาที่เกิดขึ้น ณ เวลานั้นได้เลย)
กระบวนการทำงาน หรือขั้นตอนการทำงานของ PCR กับ Real time PCR (Work flow PCR & Real time PCR)
PCR
เก็บตัวอย่าง เช่น พืช,DNA, จุลินทรีย์(Sample collection)
บดตัวอย่างให้เข้าเป็นเนื้อเดียวกัน เพื่อให้จับกับสารละลายทำให้เซลล์แตกได้ (Homogenization)
DNA extraction and purification
2กับ3เรื่องเดียวกันคือการสกัดDNAจากตัวอย่าง
วัดปริมาณ DNA ด้วย Spectrophotometer
(DNA quantification)
การเตรียมหลอด PCR และปฏิกิริยา PCR
(PCR reaction setup)
เข้าเครื่อง PCR
(DNA amplification)
วิธีการตรวจสอบ PCR Product ใช้Agarose gel electrophoresis ใช้กับDNA/RNA,SDS-PAGE ใช้กับ Protein (gel electrophoresis)
ย้อมเจล (stain and dostain)
stain and destain
REAL TIME PCR
เก็บตัวอย่าง เช่น พืช,DNA, จุลินทรีย์(Sample collection)
บดตัวอย่างให้เข้าเป็นเนื้อเดียวกัน เพื่อให้จับกับสารละลายทำให้เซลล์แตกได้ (Homogenization)
DNA extraction and purification
2กับ3เรื่องเดียวกันคือการสกัดDNAจากตัวอย่าง
วัดปริมาณ DNA ด้วย Spectrophotometer
(DNA quantification)
การเตรียมหลอด PCR และปฏิกิริยา PCR
(PCR reaction setup)
ขั้นตอนที่1-5เหมือนกันกับPCR ต่างกันที่ขั้นตอนที่6
DNA amplification + Detection
มี Detection เพื่อตรวจสอบสารสีเปล่งเเสง Fluorescent (cancerจับสารสี)
Coronavirus structure
โปรตีน S (Spike protein) เป็นโปรตีนที่ยื่นออกมาจาก envelope ของอนุภาคไวรัสมีลักษณะคล้ายมงกุฎและมีความสำคัญในการก่อโรคในคน
โปรตีน M และ E เป็นส่วนประกอบบนเปลือกของไวรัส
โปรตีน N เป็นโปรตีนที่จับบนจีโนมของไวรัส (RNA Genome)ทำให้เกิดแคปซิดที่สมมาตรแบบเกลียว (helix)
Spike proteinจะจับกับ ACE2 receptor แล้วก่อโรคในคน
การเก็บตัวอย่าง Covid-19 หรือ SARs-CoV-2
(Specimen collection to detect the genetic material of SARs-CoV-2)
ควรเก็บตัวอย่างผู้ป่วยให้เร็วที่สุดเพราะGenome RNAพร้อมจะถูกย่อยสลายได้ง่ายๆ แต่มีปุ่มๆที่ขาเยอะมากทำให้ทนกว่าไวรัสRNAตัวอื่น
ผู้ป่วยที่มีอาการรุนแรง ปอดบวม ปอดอักเสบ ควรเก็บตัวอย่างจาก ระบบทางเดินหายใจส่วนล่าง เช่น bronchoalveolar lavage (BAL), tracheal aspirate, sputum ให้ ใส่ภาชนะปลอดเชื้อ ไม่ต้องใส่
UTM/VTM
BAL เป็นเทคนิคการน้ำของเหลว (น้ำเกลือ/normal saline) ฉีดลงในทางเดินทางหายใจส่วนล่างและดูด กลับคืนในระยะเวลาสั้นๆ จะเก็บพวกcellและสารต่างๆจากถุงลมและหลอดลมส่วนปลาย
กรณีที่มีอาการอุจจาระร่วง เก็บอุจจาระ 10-20 ml หรือ 5-10 g ใส่ในภาชนะปลอดเชื้อ เก็บตัวอย่างแล้วต้องแช่ในกระติกน้ำแข็งทันที หรือ 4-8 องศาเซลเซียส แล้วส่งห้อง LAB ภายใน 24 ชม. (ถ้าไม่ทันให้เก็บท่ี -70 องศาเซลเซียส)
Sample collection of COVID-19
ตัวอย่าง Covid-19 swab2แบบ 1.Nasopharyngeal swab (โพรงจมูก) 2.Oropharyngeal (ช่องปากกับคอหอย)
Transport media เป็นมีเดียที่ใช้ในการนำส่งตัวอย่างตรวจมายังห้องปฏิบัติการ
VTM = พวกAntibodies เช่น penicillin, streptomycin, gentamycin/amphotericinB, fungizone (ควรเก็บท่ี 4องศาเซลเซียส) ราคาแพงกว่า UTM
UTM = vancomycin และ colistin (เก็บท่ี Room temperature) ราคาถูกกว่า VTM เนื่องจากเก็บในอุณหภูมิห้องได้
องค์ประกอบที่คล้ายกัน คือ isotonic buffer(ทำให้ไวรัสคงที่), viral stabilizer(ป้องกันไม่ให้ไวรัสถูกทำลาย)
ตัวอย่างตรวจท่ีใส่ใน VTM/UTM สามารถนำไปใช้ในการตรวจหาสาร พันธุกรรมและแยกเชื้อไวรัสได้
การตรวจสอบ COVID-19
(Detection of COVID-19 disease)
มักนิยมใช้บริเวณที่เรียกว่า Open reading frame (ORF)1a และORF1b ทำหน้าท่ีสร้าง non-structural protein อย่าง น้อย 16 ชนิดที่เป็นองค์ประกอบGenome แบบRNA
มีคุณสมบัติเป็นเอนไซม์ replicationทำหน้าที่เกี่ยวกับการ สร้างRNAใหม่ RNA recombination และการเพิ่มจำนวนไวรัสในเซลล์ติดเชื้อ
ยีนเป้าหมายของเชื้อ SARS-CoV-2 (สถาบันวิจัยวิทยาศาสตร์สาธารณสุขกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์)
ไทย คือ N และ RdRp gene
เทคนิคที่ใช้วินิจฉัยในการเกิดโรค Molecular diagnosis of COVID-19
Real-time PCR (ORF-1b or N gene)
กรณีไม่รู้สายพันธุ์ใหม่ใช้ sequencingแทน Nucleotide sequencing (ORF-1b or N gene)
การทำงานของ Real time PCR (How does Real-time PCR work?)
การทำงานของ Real time PCRประกอบไปด้วย 3 phase
Initial phase: ช่วงที่แสง Fluorescence ต่ำกว่าที่เครื่องจะตรวจวัดได้
Exponential phase: ช่วงที่ Fluorescence เพิ่มข้ึนเป็น Exponential
Plateau phase: เป็นช่วงท่ี Fluorescence เริ่มคงที่
Threshold คือ เส้นตรงท่ีลากขนานกับแกนจำนวนรอบของการทางานของ real-time PCR บน กราฟซึ่ง เป็นเส้นที่อยู่เหนือเส้น baseline(ค่าที่เครื่องสามารถตรวจจับ Fluorescenceได้)
Ct (cycle threshold) values = ค่า จำนวนรอบของการทำงานของ real-time PCR ที่ให้ Fluorescenceได้ ตัดกับเส้น Threshold เป็นค่าที่บ่งชี้ความเข้มข้นของเชื้อ COVID-19 ที่ต้องการทดสอบโดย มีความสัมพันธ์แบบผกผันกับความเข้มข้นเชื้อ
(ค่า Ct values มากเชื้อน้อย, ค่า Ct values น้อยเชื้อมาก)