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Biocell : Méthodes d'étude - P4 - Coggle Diagram
Biocell : Méthodes d'étude - P4
Microscope
Lim résolution oeil humain =
100 µm
Image grossie d'un petit objet : grossissement ; résolution : sép détails
MO
Lim résol class de
200µm
: peut pas diff 2 objets proches de moins ; super résol, lim <
50nm
Détecteur
,
oculaires
(agrand),
syst opt
(lentille, miroir),
objectif
(det grossisst/résol),
échantillon
,
condenseur
(concentre lum sur éch),
source lum
Grossisst jusqu'à x2000
; résol = + petite d entre 2 pts -> distinguer ; phen de diffraction ; résol
d = (0,61λ) / n Sin(α)
, α = demi angle ouverture d'objectif
Coloration = trait préalable :
incompat avec obs éch vivant
Fixation
éthanol, aldéhydes (formaldéhyde, glutaraldéhyde
) : bloquent constituants C
Perméabilisation avec détergents
: trous dans membr
Inclusion (résine) ou congel
: solidifier
Coupes fines
: lum - - > traverser
Préparation de coupes fines
Fixation
:
éthanol, aldéhydes
Imprégnation de paraffine
: compo hydrophobe <- nécess déshydra
1 more item...
Colorants / Ac
Eosine, hématoxiline
/ Ac couplé enzyme
HRP
Pour
histologie
Hémalun-éosine-safran (HES)
Hémalun
: basique, contient
hématoxyline
, colore
noy
en
violet
Eosine
: acide,
cytosol
->
rose
Safran
:
collagène
->
jaune-orangé
Immunohistochimie
Ac couplé à enz
: révél par un substrat transf en prod (
brun
)
Cellules vivantes, sans prépa
A contraste de phase
Transf changt indice de réfraction dans un éch en changt d'ampli lumineuse
Cellules Hela
: voit noy / nucléole
Cellules endoth d'artère pulmonaire bovine (cours de migration)
A fond noir
Eclairage par un faisceau oblique : seule lum trav éch est déviée & att objectif
Fond noir, éch clair
Fibroblastes en culture
MO à fluorescence
Molcs fluo pour visualiser constituants C (prots ou acides nucléiques)
Sélection parmi lum blanche de lgueur onde excitation : miroir sélectif réfléchit lum d'excit & laisse passer lum émise ; 2nd filtre sélec longueur onde émise,
doit etre diff de celle d'excitation
Fluorochromes
FITC : isothiocyanate de fluorescéine
Fluro verte
Couplé Ac ou prot intérêt ; étapes préalables de fixation, perméabilisation, satur des sites non reconnus
Rhodamine
: fluo rouge, couplé à Ac et prot intérêt
Fixation, perméabilisation, saturation des sites non reco :
incompatible avec cellules vivantes
Dapi
: fluo bleue, ADN du noy des C
BET
: fluo orange, ADN du noy des C
GFP
, prot autofluo :
cellules vivantes
Nombreux feuillets bêta en tonneau : aas qui forment fluorochrome à int
Gène codant associé à celui de prot à visualiser ; gène chimère inséré, prot exprimée = fluo
Fibroblaste
expr
prot EB3 +TIP
Cellules mortes, avec préparation
MO confocale
Détecteur reçoit
que
lum passant passant par pinhole : élim fluo parasite au dessus et au dessous du plan focal
Balaye éch pt par pt en dépla faisc laser sur surf -> image 2D, peuvent = combi pour former image 3D
Limites MO
Résol limitée par diffraction, pas sup à
180nm
, sauf à super-résolution, possible atteindre résol de
40-50nm
PALM/STORM
Fluo, puis extinction de molcs uniques ; localisation centre tache de diffra ; reconstitution info de l'image
ME à transmission
Faisc e- par canon à e-, condenseur et lentille électromagn (objectif, projecteur), écran/cam digit
Coupes ultrafines
Fixation
:
tétraoxyde d'osmium OsO4, glutaraldéhyde
, froid (congel trs rap)
Déshydra
: bain
éthanol
C croiss
Inclusion en résine époxy
: solidifier
Coupes (
30nm
) aide ultramicrotome
Contraste avec métaux lourds (U, Pb, Os...)
: opaques aux e-
Coloration
Plus Z élevé, + e- arrêtés et plus image sombre
Ac couplés à billes d'or colloïdal : colo spé de certaines prots