Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
COVID-19 disease with Real-time…
COVID-19 disease with Real-time PCR tehnique
PCR reaction
มีทั้งหมด
3
ขั้นตอน
1.Denaturation
ขั้นตอนการแยก DNA สายคู่ให้เป็นสายเดี่ยว โดยใช้อุณหภูมิสูง 94-95°C
2.Annealing
ขั้นตอนที่สำคัญ primer เข้ามาเกาะกับ DNA สายเดี่ยว primer มี 1 คู่ 2 เส้น คือ Forward และ Reverse โดยใช้อุณหภูมิ 37-65°C
3.Synthesizing
สังเคราะห์ DNA สายใหม่ด้วย Enzyme Taq polymerase โดยใช้อุณหภูมิ 72°C
พื้นฐานของ PCR เป็นเทคนิคหรือวิธีการเพิ่มปริมาณ DNA ของยีน ในขนาดทดลอง In vitro PCR ทำประมาณ 30-40 รอบ (2กำลังn)
เปรียบเทียบระหว่าง Conventional PCR และ Real Time PCR
- PCR
เป็นการเพิ่มปริมาณ DNA ที่เราสนใจ ให้ได้ปริมาณมากพอที่จะทำการตรวจสอบได้ อาศาัยการทำงานของ Enzyme Taq polymerase ไม่มีสารสีเปล่งแสง
กระบวนการทำงาน
1.Sample collection
: เก็บตัวอย่าง
2.Homogenization
: การสกัด DNA จากตัวอย่าง
3.DNA extraction and purification
: บดตัวอย่างให้เป็นเนื้อเดียวกันเพื่อสัมผัสกับสารละลาย
4.DNA quantification
: การวัดปริมาณDNA โดยเครื่อง Spectophotometer
5.PCR reaction setup
: การเตรียมหลอด PCR และ การทำปฏิกิริยา PCR
1 more item...
- Real Time PCR
หลักการเหมือนกับ PCR แต่มีการใช้สารสีเปล่งแสง หรือ Fluorescence dry ในการตรวจสอบปริมาณ DNA ตรวจสอบได้แบบ real time สารสีที่นิยมใช้ 1.SYBR green 2.TaqMan(5'nuclease)
กระบวนการทำงาน
1.Sample collection
2.Homogenization
3.DNA extraction and purification
4.DNA quantification
5.PCR reaction setup
1 more item...
coronavirus structure
โปรตีน S (Spike protein) เป็นโปรตีนที่ยื่นออกมาจากเปลือกนอก (envelope) ของอนุภาคไวรัสลักษณะคล้ายมงกุฎ มีความสำคัญในการก่อโรคในคน
Spike protein จะจับกับ ACE2 (Angiotensin converting enzyme) ทำให้ร่างกายอ่อนแอ
โปรตีน MและE เป็นส่วนประกอบบนเปลือกของไวรัส
โปรตีน N เป็นโปรตีนที่จับบนจีโนมของไวรัสทำให้เกิด capsid
COVID-19 (SARs-CoV-2)
อาการ
มีไข้ 37.5°C ขึ้นไป
ไอเจ็บคอ
ท้องเสีย
ปวดหัว
การเก็บตัวอย่าง
ควรเก็บตัวอย่างเร็วที่สุด เริ่มมีอาการ 3-5 วัน เพราะ จีโนมเป็น RNA ย่อยสลายง่าย
ผู้ป่วยที่มีอาการรุนแรง ควรเก็บจากระบบทางเดินหายใจส่วนล่าง เช่น
BAL (bronchaolveolar lavage)
BAL (bronchaolveolar lavage)
เทคนิคการนำของเหลว(น้ำเกลือ,normal saline) ฉีดลงในทางเดินหายใจส่วนล่างและดูดกลับคืนในระยะสั้นๆ
รายที่มีอาการอุจจาระร่วง เก็บอุจจาระ 10-20 ml หรือ 5-10 g ใส่ในภาชนะปลอดเชื้อ
เก็บตัวอย่างแล้วแช่ในกระติกน้ำแข็งทันที แล้วส่งห้องแลปภายใน 24 ชม.(ถ้าไม่ทันให้เก็บที่ -70°C)
ตัวอย่างการเก็บ
1.Nasopharyngeal swab = โพรงจมูก
2.Oropharyngeal swab = ปาก,คอหอย
การตรวจสอบ
ยีนเป้าหมายของเชื้อ
SARs-CoV-2
(สถาบันวิจัยวิทยาศาสตร์สาธารณสุขกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์)
-ไทย
หน่วยงาน National Institute of Health ยีนเป้าหมาย 1.N และ 2.RdRp gene
Real-time PCR
Amplification plot (3 phases)
Threshold = เส้นตรงที่ลากขนานกับแกนจำนวนรอบของการทำงานของ real-time PCR บนกราฟซึ่งเป็นเส้นที่อยู่เหนือเส้น baseline
Ct (cycle threshold) values = ค่าจำนวนรอบของการทำงานของ real-time PCR ที่ให้ FR ตัดกับเส้น Threshold
"ค่ามากเชื้อน้อย,ค่าน้อยเชื้อมาก"
-ไทย = 35 values ติด COVID-19
1.Initial phase
: ช่วงที่แสง Fluorescence ต่ำกว่าที่เครื่องจะตรวจวัดได้
2.Exponential phase
: ช่วงที่ FR เพิ่มขึ้นเป็น Exponential
3.Plateau phase
: เป็นช่วงที่ FR เริ่มคงที่
