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TERAPIA GENICA - Coggle Diagram

- - - - veicoli che servono per portare il gene nelle cellule del paziente
        
        Vettori virali modificati generalmente
    - - In vivo
        
        vettore iniettato direttamente nel paziente, quindi sul tessuto in vivo
      - Ex vivo
        
        le cellule del paziente sono estratte, posta in coltura per essere trattate con il vettore virale, e solo successivamente re-introdotte nel paziente una volta che la modificazione è avvenuta.
    - - Mancato funzionamento del S.I.
        
        Si divide in Primaria e Secondaria
        
        Primaria
        
        se la causa sono dei difetti genetici che sono presenti sin dalla nascita
        
        Secondaria
        
        se insorgono successivamente nel corso della vita
        
        Come negli individui affetti da HIV
    - - approccio con l’obbiettivo di stimolare o ristorare la capacità del sistema immunitario di combattere le infezioni e malattie
- - - - Regione PSY: essa contiene un segnale di impacchettamento, che permette l’assemblaggio del genoma virale dentro il capside del virus una volta che tutti gli elementi sono prodotti
      - monte e a valle del cluster genico troviamo poi delle regioni 5’ e 3’ LTR, che sta per long terminal repeats
        
        esse contengono la zona U3 che contiene un promotore ed un enhancer
        
        necessari per esprimere le proteine virali ma dannosi nei vettori in quanto soprattutto l’enhancer può agire su vari geni anche a grande distanza
    - - quando si produce il vettore virale il genoma viene tagliato
        
        nello specifico il cluster di geni gag, pol e env viene eliminato e sostituito con il nostro gene di interesse
        
        Però perché la particella virale effettivamente si formi e questo elemento genomico possa essere posizionato al suo interno ci servono comunque i geni gag, pol ed env, che vengono clonati all’interno di un vettore plasmidico eucariote se non addirittura due, uno con gag e pol ed uno con env
        
        VETTORE PLASMIDICO: essi sono posizionati a valle di un promotore funzionante e con una sequenza di poli-A per l’espressione
        
        A questo punto i due plasmidi e il DNA virale alterato possono essere inseriti in una cellula, nello specifico una linea cellulare adatta al packaging, in cui sono espressi ed assemblati
        
        con il genoma dotato del gene di nostro interesse invece di quello wild-type virale
        
        simulando una vera infezione e producendo i vettori virali che ci servono per la terapia genica
        
        conservando le zone LTR e la sequenza psy in modo da permetterne l’espressione ed il packaging nel vettore virale
      - Problema della MUTAGENESI INSERZIONALE
        
        non solo si inseriscono casualmente nel genoma ma spesso tendono ad integrarsi vicino a zone regolatorie
        
        Rischio alterazione espressione genica
        
        per queste problematiche e per lo sviluppo di cancerogenesi i primi trial clinici furono proprio sospesi
        
        RISOLUZIONE: vettori virali detti SIN ossia SELF-INACTIVATING
        
        Dati da una delezione nella regione U3
        
        Questo provoca un blocco del funzionamento del promoter e dell’enhancer nell’LTR
        
        Questo fa sì che una volta integrata la sequenza non riesce ad agire sui geni circostanti e a dis-regolarli come avveniva precedentemente, in quanto l’enhancer che agiva anche a grande distanza è eliminato
        
        Tuttavia occorre inserire un PROMOTRE INTERNO ETEROLOGO
        
        per far funzionare comunque l’espressione del gene terapeutico, che altrimenti sarebbe anch’essa bloccata
  - - - In realtà i vettori diversamente dai virus mancano dei geni rep e cap, per cui non sono nemmeno in grado di integrarsi e restano episomali
        
        Tutti questi aspetti li rendono facilmente controllabili e sicuri per la terapia genica
    - - allo stesso tempo il genoma virale ssDNA modificato
        
        Invece che i geni virali infatti troviamo un promotore, un introne e la sequenza del gene target, seguito da una coda di poli-a
        
        l’introne serve per facilitare l’espressione del gene nella cellula
    - - così da permettere l’ingresso del virus adeno-associato nella fase litica e far produrre le particelle virali
    - - Termine specifico per la tecnologia adenovirale, a differenza dei retrovirus che anch'essi sono svuotati dei geni virali ma prendono il nome di SIN
      - sono estremamente sicuri ed utili per la terapia genica transiente e in cellule post-mitotiche differenziate, come i neuroni o la retina
- - - - esse possono venire coltivate e transfettate, con un retrovirus o un lentivirus in grado di integrare il gene target
        
        si selezionano le cellule in cui la procedura è avvenuta con successo
        
        Infine si possono ri-iniettare nel paziente senza problemi di rigetto dato che sono le stesse presenti nel suo corpo
  - - - molto usata per trattare cellule differenziate come quelle tumorali, muscolari e del sistema nervoso
        
        I vettori sfruttati sono quasi sempre gli AAV
    - - si applica esclusivamente alle cellule staminali o HSC (Cellule staminali ematopoietiche)
        
        si utilizzato vettori ottenuti da retrovirus e lentivirus
        
        In particolare i SIN
        
        Utilizzata per Immunodeficienze primarie (ADA-SCID)
- - - - Inserire un gene apoptotico come p53
        
        per rendere le cellule più sensibili a trattamenti radio-chemioterapici e indurle a morire
    - - In modo che esso venga somministrato al paziente in modo sistemico ma agisca solo sulle cellule tumorali
    - - Cellule CAR-T
        
        linfociti geneticamente modificati per riconoscere antigeni tumorali specifici di quel cancro e in quel paziente
        
        per ottenere questo risultato occorre prima caratterizzare il tumore ed identificare un antigene unico per esso o sovraespresso
        
        Quindi cellule T normali estratte dal paziente possono essere transfettate, usando un lentivirus o un altro meccanismo stabile, con un gene per la produzione di un TCR modificato
        
        frammento scFv di anticorpo monoclonale nella sua parte recettoriale esterna
        
        specifico per l’antigene da riconoscere
        
        nella parte interna contiene un dominio co-stimolatorio
        
        In questo modo la cellula T esprime un TCR in grado di riconoscere l’antigene tumorale, e il complesso co-stimolatorio all’interno trasduce il segnale una volta avvenuto il legame, attivando la cellula car-T e facendo distruggere la cellula tumorale
        
        selezione prima di re-infonderle nel paziente
        
        tumori difficili da curare con meccanismi tradizionali sono stati risolti con successo grazie a questo sistema
        
        Rischi
        
        in questo caso se le cellule T modificate iniziano a moltiplicarsi per clonazione c’è il rischio di una sindrome da rilascio di citochine, in cui troppe citochine vengono prodotte iper-attivando il sistema immunitario
        
        Sistema molto costoso, utilizzato solo quando le altre strategie falliscono
      - aiutando le cellule del nostro sistema immunitario a combattere in modo specifico il cancro
    - - utilizzando un virus per targettare ed uccidere le cellule tumorali.
  - - - i pazienti sono allora particolarmente soggetti allo sviluppo di infezioni e tumori
    - - Trapianto di midollo
        
        problema di trovare donatori con aplotipi HLA compatibili, e il rischio di rigetto e di dover assumere immunosoppressori a vita che ne consegue
      - Terapia genica
        
        Si usa approccio ex-vivo
        
        vengono isolate le cellule staminali ematopoietiche HSC
        
        trasfettarle con un vettore retrovirale o lentivirale, in modo da inserire la sequenza corretta del gene alterato
        
        una volta selezionati gli elementi modificati con successo essi si possono ri-immettere nel paziente
        
        Vantaggio selettivo rispetto alle cellule naturali difettose, che muoiono prima, per cui riescono a ripopolare velocemente il midollo
        
        sono trattabili andando a inserire come transgene l’elemento mutato, all’interno di cellule staminali ematopoietiche ottenute o dal midollo, o in modo meno invasivo dal circolo sanguigno
        
        Nel caso vengono ottenute nel circolo sanguigno viene usata una G-CSF
        
        ossia una citochina granulocite-colony stimulating factors che le porta in circolo, da cui possono essere facilmente prelevate
        
        Rischi
        
        Non risolve del tutto il problema
        
        Allunga di qualche anno la vita di pazienti spacciati
        
        Leuchemiogenesi
        
        trasformazione cellulare degli elementi immunitari modificati, causando un tumore del sangue
        
        Esempi di trattamenti
        
        ADA-SCID
        
        difetto nel gene ADA che codifica per l’enzima adenosina deaminasi, importante nel metabolismo dei nucleotidi
        
        quando non funziona impedisce il differenziamento dei linfociti T
        
        X-SCID
        
        gene mutato si trova sul cromosoma X, tratta della catena gamma del recettore per l’interleuchina-2, senza la quale il recettore non è efficiente e risponde poco al segnale del mediatore chimico
        
        Essendo IL-2 un elemento centrale nella risposta immunitaria in assenza della sua stimolazione le cellule immunitarie non si differenziano e non si espandono, soprattutto per quanto riguarda i linfociti e le natural killer NK
        
        SINDROMI WAS
        
        difetto nel gene che codifica per la WAS protein o WASp
        
        elemento fondamentale che connette il segnale esterno con l’organizzazione intracellulare del citoscheletro, e quando alterata non permette ai precursori mieloidi di differenziarsi nei vari sottotipi cellulari
        
        Malattia Granulomatosa Cronica CGD
        
        malfunzionamento nel complesso della NADPH ossidasi
        
        i geni coinvolti sono diversi, dato che il complesso in questione è formato da molte subunità, ma nel 70% dei casi il gene responsabile è CYBB, localizzato su cromosoma X e codificante per la gp91
        
        In ogni caso quando anche un solo gene che costituisce la NADPH ossidasi è mutato si perde la sua funzione, portando all’incapacità dei macrofagi di produrre ROS e NO nel fagosoma per uccidere e distruggere i patogeni fagocitati
- - - - tagliare selettivamente sequenze di DNA ed inserirne di nuove usando a nostro favore i sistemi di riparazione per ricombinazione omologa delle cellule
        
        ovviamente anche qui occorre transfettare una sequenza, ma non servono più vettori virali e l’inserzione è molto controllata
      - Cas9 è una proteina o nucleasi appartenente a una famiglia di mega-nucleasi, in grado di riconoscere grandi sequenze sul genoma e tagliare in un sito specifico
        
        Cas9 si dirige quindi verso una regione specifica, non come gli enzimi di restrizione che riconoscono piccole sequenze diffuse, e in particolare è molto efficiente in quanto guidata da una sonda di RNA, CRISPR, complementare alla zona target dove la nucleasi deve agire
        
        il sistema CRISPR/Cas9 si può facilmente ingegnerizzare producendo RNA ad oc per far tagliare regioni del genoma da noi volute, e quindi i double strand breaks così formati possono essere riparati dalla cellula per ricombinazione omologa andando a usare come linea guida una sequenza di DNA da noi fornita
        
        in questo modo è possibile inserire la controparte funzionante di geni mutati, o correggere delle alterazioni
        
        Andiamo a trasfettare contemporaneamente la sequenza target e Cas9 assieme all'RNA giuda
  - - - i cosiddetti fattori OSKM
        
        Si tratta di Oct4, Sox2, cMyc e Klf4
      - grazie alla loro azione si è osservato nei primi anni 2000 che da fibroblasti parzialmente differenziati si riuscivano ad ottenere cellule staminali equivalenti a quelle embrionali
        
        esse si possono poi ri-differenziare a piacimento, per usarle in vari tipi di terapie.
      - sistema che può essere utile per rendere la terapia genica ancora meno invasiva
        
        invece che ricavare cellule staminali dal paziente bastano cellule somatiche già differenziate, che poi vengono rese iPSC tramite trasfezione dei fattori OSKM, e poi possono venire trattate in coltura, per inserire un transgene, per correggere un problema genetico usando CRISPR/Cas9, e così via, fino a ri-inserirle nel paziente
- - - - RETROVIRUS (RNA)
        
        Envelope di lipidi e glicoproteine e un capside proteico
        
        Genoma organizzato in 3 macroelementi
        
        una parte codifica per le proteine dell'envelope (Cluster ENV)
        
        una parte per le proteine del capside e della matrice (Cluster GAG)
        
        Una parte codifica per gli enzimi proteinasi, integrasi e polimerasi (Cluster POL)
        
        A causa del genoma piccolo è possibile clonare geni fino a 8kbp
        
        Infezione
        
        Primo step: retrotrascrizione RNA in DNA
        
        In modo che si possa poi integrare nel genoma dell’ospite
        
        La sua utilità sta proprio nel fatto che si integra in modo stabile nel genoma dell'ospite
        
        anche se questo causa problemi di mutagenesi inserzionale
        
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        da qui viene quindi trascritto in RNA e tradotto in proteine per assemblare nuove particelle virali
        
        TROPISMO: essi riescono ad infettare solo cellule che si dividono e sono replicative, e non quelle già differenziate e post-mitotiche
        
        “Tropismo” in biologia indica la preferenza di un virus (o di un altro agente) per un certo tipo di cellule o tessuti
        
        Espressione del transgene è sempre bassa e costitutiva, per cui abbiamo che la proteina viene sempre prodotta ma a livelli basali
        
        Usati per la terapia genica ex-vivo
      - LENTIVIRUS (RNA)
        
        Dimensioni e capacità di clonaggio simile al retrovirus
        
        Sempre in grado di integrarsi nel genoma
        
        utilità di una espressione costitutiva e costante a livelli basali
        
        sempre con il problema della mutagenesi inserzionale
        
        A differenza dei retrovirus, i lentivirus sono in grado di infettare anche cellule già differenziate e che non si dividono più, oltre che quelle in replicazione
        
        utile perché non occorre attendere che la cellula si replichi affinché avvenga l'integrazione
        
        Aspetto fondamentale quando si trattano le cellule staminali
        
        Se esse dovessero dividersi perché il gene possa inserirsi infatti si rischierebbe di perdere la staminalità nel frattempo, in quanto già dopo poche divisioni esse iniziano a differenziarsi.
        
        sono sempre usati per la terapia genica ex-vivo
        
        Hanno una patogenicità maggiore rispetto ai retrovirus
      - ADENOVIRUS (dsDNA)
        
        25-45 kbp: vettori con maggiore capacità di clonaggio
        
        Il loro DNA entra nella cellula insieme al capside
        
        il genoma poi all'interno viene scoperto e arriva a nucleo
        
        dove ci rimane in forma EPISOMALE
        
        Questo implica anche che gli adenovirus sono ottimi per infettare cellule già differenziate e che non si dividono
        
        in quanto in cellule in divisione potrebbero essere facilmente persi
        
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        il problema della mutagenesi inserzionale qui non esiste
        
        problematica di patogenicità in quanto gli adenovirus possono causare una forte risposta infiammatoria
        
        come è accaduto con i vaccini covid che sfruttavano vettori adenovirali
        
        Utilizzabili sia per terapia genica in vivo (preferita) che ex vivo
        
        Promotore segue il ciclo vitale del virus permettendo l'espressione della proteina sono in certi momenti ma in abbondanti quantità
        
        il transgene viene espresso in modo rapido e transiente
      - VIRUS ADENO-ASSOCIATI (ssDNA)
        
        Genoma e capacità di clonaggio più piccoli in assoluto
        
        Genoma di appena 5 kbp
        
        Come gli adenovirus non si integrano ma restano in forma EPISOMALE
        
        Per cui non c'è rischio di mutagenesi inserzionale
        
        Ma nemmeno di patogenicità o rischi di infiammazione
        
        Essi contengono solo i geni rep e cap, che da soli non sono sufficienti a permetterne la replicazione
        
        Se quindi non c’è un adenovirus o herpes virus di supporto l’adeno-associato entra in una fase di latenza e si integra, sempre però nella stessa posizione del genoma e quindi senza causare problemi
        
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        Per queste caratteristiche i virus adeno-associati sono adatti alla terapia genica in cellule che non si dividono e sono già differenziate
        
        Si usano sia per la transgenesi in vivo che ex-vivo
        
        il transgene viene espresso sempre in modo transiente ma più costitutivo degli adenovirus
        
        In modo da non essere persi
        
        Sono i vettori più utilizzanti, in quanto sono perfetti per la terapia genica transiente
        
        E molto sicuri rispetto alle altre possibilità
      - Se vogliamo ottenere
        
        Trasferimento genetico stabile
        
        RETROVIRUS e LENTIVIRUS
        
        che sono in grado di INTEGRARSI
        
        Trasferimento genetico transiente
        
        ADENOVIRUS o ADENO-ASSOCIATI
        
        vettori virali che non si integrano
        
        oppure per trattare cellule post-mitotiche in cui l’integrazione non sarebbe comunque utile
        
        durano quindi da qualche giorno a qualche mese