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TRANSGENESI ANIMALE - Coggle Diagram

- - - - Gli altri 2 invece prendono il nome di KNOCK-IN dato che vengono aggiunti
  - - - Modelli di ricerca
        
        Modello per la malattia
        
        Modello di studio per la funzione genica
      - Produzione di Proteine Ricombinanti
      - Sviluppo di Terapia Genica
    - - Biotecnologie tradizionali
        
        Incroci
        
        Es. Bovini che producono quantità elevate di latte e carne
        
        MA sono lenti e con risultati imprevedibili
        
        Dato che si ha una ricombinazione del DNA diffusa a tutto il genoma
      - Tecnologie del DNA ricombinante
        
        Inserimento di geni specifici o sequenze specifiche con la TRANSGENESI
        
        Modificare un gene con la GENE TARGETING
        
        Mutagenesi mirata in vitro
        
        Per poi inserire la sequenza tramite transgenesi
        
        Ricombinazione omologa in vivo
    - - Costano poco
      - Si riproducono in fretta
      - Sono piccoli ma non troppo
      - GENOMA OMOLOGO A QUELLO UMANO
        
        Ricombinazione omologa molto efficiente nelle cellule staminali
        
        Facile da manipolare per ottenere modelli di malattie umane rispetto ad altri mammiferi
    - - Questo implica la presenza della modificazione anche nei gameti
        
        Quindi la possibilità di trasmetterla alla prole producendo una LINEA TRANSGENICA tramite riproduzione
        
        Questo differenza la transgenesi animale dalla terapia genica
        
        La terapia genica mira ad inserire un gene in un solo tessuto per fini terapeutici qualora fosse necessario
        
        Senza possibilità di trasmissione della modificazione alla prole, vengono modificate solo le cellule somatiche
        
        Ma in ogni caso i geni inseriti devono integrarsi nel genoma in maniera stabile
        
        Anche se parliamo di un processo di difficile controllo
        
        come e dove avviene questa inserzione, e se si va a integrare in punti sbagliati, come in un gene o in zone regolatrici, potrebbe causare un effetto tossico andando a bloccare o dis-regolare l'espressione di un gene
        
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      - E' chiaro quindi che le procedure di transgenesi vanno eseguite nelle prime fasi di sviluppo embrionale
- - - - Si può vedere il corpo polare derivato dalla divisione asimmetrica dell'oocita e la zona pellucida (guscio che lo avvolge)
    - - I 2 pronuclei si fondono
        
        La cellula inizia a dividersi
      - MORULA
        
        Segmentazione: lo zigote si divide più volte
        
        Quando arriviamo tra le 8 e le 16 cellule ammassate, ancora non differenziate (TOTIPOTENTI: possono generare ogni cellule di ogni tessuto)
        
        BLASTOCISTI
        
        EMBRIONE
        
        Inizia il processo di differenziazione
        
        Gastrulazione inizia già dal 5-6 giorno
        
        Totipotenti = cellule che possono dare origine a tutto: embrione + strutture extra-embrionali (placenta). → Questo vale solo per le primissime cellule (zigote e blastomeri fino a circa 8 cellule).
        
        Pluripotenti = cellule che possono dare origine a qualsiasi tipo di cellula dell’embrione, ma non più alla placenta. → Esempio: le cellule della massa cellulare interna della blastocisti.
        
        Multipotenti = cellule più specializzate, capaci di differenziarsi solo in linee cellulari di un tessuto o organo (es. cellule staminali ematopoietiche → tutti i tipi di cellule del sangue).
        
        Prima della gastrulazione le cellule della massa interna sono pluripotenti.
        
        Durante la gastrulazione non sono più indifferenziate, perché iniziano a impegnarsi in un destino preciso (ectoderma, mesoderma, endoderma).
        
        Dopo la gastrulazione, diventano progressivamente multipotenti o anche più specializzate, man mano che si forma ciascun organo.
        
        Nella morula compare una cavità interna piena di liquido chiamata BLASTOCELE
        
        Si forma così la blastocisti che è formata da:
        
        Trofoblasto
        
        Strato esterno, che forma la placenta e le strutture di sostegno
        
        Inner Cell Mass
        
        Gruppo di cellule che darà origine all'embrione vero e proprio
        
        Con suo impianto nell'endometrio
  - - - O si congela l'embrione e lo si conserva
      - o si innesta nell'utero di una madre surrogata onde evitare degenerazione
    - - Nella blastocisti troviamo cellule pluripotenti che possono dare origini a qualunque tipo di tessuto
- - - - trasferire dei nuclei geneticamente modificati, ottenuti da colture di cellule modificate con varie strategie, all’interno di oociti denucleati
        
        è possibile utilizzare anche dei nuclei di cellule differenziate o parzialmente differenziate come i fibroblasti
        
        quanto il citoplasma dell’oocita contiene dei fattori in grado di riprogrammare da zero e ripristinare la staminalità del nucleo, andando ad esempio ad eucromatinizzarlo
        
        Approccio utilizzato per la PECORA DOLLY
        
        il genoma esattamente identico a quello di una pecora, che ha donato fibroblasti già parzialmente differenziati, posti in coltura e bloccati in G1 per estrarne il nucleo
        
        Esso è stato poi inserito in oociti denucleati, in cui il nucleo era stato fisicamente
        rimosso, tramite elettroporazione
        
        gli oociti ri-nucleati sono poi stati impiantati in una madre adottiva surrogata dopo qualche replicazione, e alla fine si è ottenuta la pecora Dolly identica alla donatrice
        
        anche qui l’efficienza è sempre molto bassa e sono serviti centinaia di oociti per ottenere il risultato desiderato
        
        Questa dimostrazione ha aperto la strada al clonaggio di mammiferi di grandi dimensioni e conseguentemente anche alla produzione di animali transgenici
        
        in cui nei nuclei estratti viene inserito il
        transgene di interesse prima di trasferirli negli oociti denucleati
    - - sviluppata per eseguire knock-out ma anche per modificare geni in modo fine e puntuale è l’editing con CRISPR/Cas9
        
        formare delle rotture a doppio filamento nel DNA, grazie alla proteina Cas9, una nucleasi batterica che si può produrre in modo ricombinante
        
        essa agisce guidata da un sgRNA (single guide), appunto noto come RNA guida, che riconosce sequenze complementari ed indirizza quindi la nucleasi a tagliare solo in quella zona
        
        La rottura del DNA permette di eseguire un knock-out o un knock-in
        
        per riparare una rottura a doppio filamento la cellula sfrutta la sequenza omologa dell’altro
        cromosoma generalmente
        
        ma se viene inserita una sequenza omologa esogena con un plasmide modificato, allora è possibile che quello venga usato come stampo, soprattutto se andiamo ad aggiungerlo in grandi quantità
        
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    - - prevede di usare una micropipetta o ago di iniezione molto sottile per inserire pochissimo DNA
        
        all’interno del pronucleo maschile appena fecondato
        
        scelto in quanto è di dimensioni maggiori e più facile da raggiungere di quello femminile
        
        Il tutto avviene sotto un micromanipolatore usando una pipetta di fissaggio che per suzione immobilizza la cellula uovo
        
        Suzione: immobilizzazione con la pipetta
        
        si va prima a bucare la zona pellucida, quindi la membrana della cellula ed infine la membrana del pronucleo maschile
        
        la cellula collassa leggermente dopo il trattamento ma si riprende velocemente
        
        Quindi la cellula si continua a coltivare fino allo stadio di morula per poi essere innestata in una madre adottiva
        
        Il DNA introdotto si integra subito nel genoma, permettendo di ottenere un animale trasngenico completo
        
        Tuttavia si tratta di un fenomeno abbastanza raro e con un’efficienza relativamente bassa, tra il 5 e il 40%
        
        infatti anche possibile che il DNA esogeno resti libero per alcune divisioni cellulari e si integri solo successivamente, generando un animale chimerico
        
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        Quando si integra poi questo spesso avviene in un numero di copie variabile e maggiore di 1, per cui si inseriscono dei multimeri nel genoma
        
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        Per cui è necessario partire con decine o centinaia di embrioni per avere alla fine un animale transgenico con successo
        
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        Ordine di Picolitri
        
        il DNA può essere sia libero che clonato in un plasmide
    - - Anche se la Microiniezione si può applicare anche a livello della BLASTOCISTI
        
        Questo perché le cellule staminali embrionali risultano essere estremamente plastiche e acquisiscono molto bene elementi esterni, persino iniettando direttamente del DNA nudo nella cavità del blastocele e nemmeno nei nuclei delle cellule
    - - aggiungere nelle fasi di sviluppo precoce dell’embrione delle cellule staminali embrionali di un altro topo già modificate per trasfezione o per infezione usando retrovirus ricombinanti
      - modificare geneticamente delle cellule staminali
        embrionali in coltura, prelevate da un altro sistema, per poi trasferirle nell’embrione che darà vita al topo transgenico
        
        Usiamo TOPI SINGENICI, ossia che hanno lo stesso genoma
        
        Per cui non ci sono problemi di rigetto
        
        Le cellule staminali embrionali dell’embrione donatore vengono mantenute in coltura, con terreni appositi che ne evitano la differenziazione e mantengono la staminalità
        
        esse possono essere modificate con sistemi standard, come la trasfezione o l’uso di vettori virali
        
        Le poche cellule in cui il processo ha avuto successo vengono selezionate con uno screening che generalmente sfrutta marker di resistenza
        
        Infine si possono inserire nell’inner cell mass della blastocisti del futuro topo transgenico
        
        con lo sviluppo della blastocisti alla fine si ottengono dei topi chimerici
        
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        le cellule staminali di topo sono particolarmente efficienti nella ricombinazione omologa generalmente gli elementi esogeni si inseriscono per crossing-over in punti precisi, evitando così il problema dell’inserzione casuale e della genotossicità
- - - - andando a aggiungere oncogeni come c-myc e Ras per knock-in, oppure facendo un knock-out di oncosoppressori come p53.