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Cobas MPX - Coggle Diagram
Cobas MPX
Test process:
The entire detection process primarily takes place on Roche's cobas® 6800/8800 fully automated nucleic acid testing systems. It covers three core stages: Sample Pre-processing, Nucleic Acid Extraction & Purification, and PCR Amplification & Detection, all supported by stringent Quality Control.
- 样本前处理 (Sample Preparation)
- The journey begins by loading the patient blood samples (typically plasma), along with the Positive Controls (from the cobas® MPX Control Kit, containing HIV-1 M/O, HIV-2, HCV, and HBV nucleic acids), and the Negative Control (cobas® NHP Negative Control Kit, which is normal human plasma without target nucleic acids) into the automated system's sample input module.
加载样本： 将待检测的患者血液样本（通常是血浆）、阳性质控品（cobas® MPX Control Kit，含有 HIV-1 M/O, HIV-2, HCV, HBV 核酸）和阴性质控品（cobas® NHP Negative Control Kit，不含目标核酸的人源血浆）加载到自动化系统的样本输入模块。
- Crucially, the Internal Control (IC) is introduced at this stage or shortly after. The IC is a non-infectious RNA construct with its own specific primers and probe. It's added to every sample and proceeds through the entire workflow – lysis, extraction, purification, and PCR amplification – serving as an essential full-process quality control.
内标加入： 内标 (IC - Internal Control) 也会在此阶段或紧随其后加入到每个样本中。IC 是一种非传染性的 RNA 构建物，它将与样本中的目标核酸一起，从头到尾经历整个提取、纯化和扩增过程，作为全程质量控制。
- The automated system then precisely adds the cobas® omni Lysis Reagent (LYS) and Proteinase Solution (PASE) to each sample. The LYS, with its strong denaturing agents, quickly lyses cells and viral particles, releasing the viral nucleic acids (DNA/RNA). PASE further breaks down proteins and inactivates nucleases, ensuring the nucleic acids are protected and ready for the next steps. Optionally, cobas® omni Specimen Diluent (SPEC DIL) might be added to adjust sample concentration or mitigate potential PCR inhibitors.
加入裂解试剂与蛋白酶： 自动化系统会将核酸分析用病毒裂解试剂 (cobas® omni Lysis Reagent - LYS) 和 蛋白酶溶液 (PASE) 精确加入到样本中。
作用： LYS 含有强变性剂，能迅速裂解样本中的细胞和病毒颗粒，释放出内部的病毒核酸（DNA/RNA）。PASE 则进一步分解蛋白质，帮助核酸充分释放并钝化核酸酶，保护核酸不被降解。
样本稀释（可选）： 根据需要，系统也可能加入样本稀释液 (cobas® omni Specimen Diluent - SPEC DIL) 来调整样本浓度或降低抑制剂影响。
- 核酸提取与纯化 (Nucleic Acid Extraction & Purification)
- 核酸结合磁珠： 裂解后的混合物进入核酸提取模块。核酸分析用磁珠试剂 (cobas® omni MGP Reagent - MGP) 被加入。在特定缓冲环境下，释放出的病毒核酸会特异性地结合到 MGP 磁珠的表面。
- 磁力分离与洗涤： 自动化系统利用磁力将结合了核酸的磁珠从混合物中分离出来。随后，清洗液 (cobas® omni Wash Reagent - WASH) 会被多次加入并移除，对磁珠进行彻底洗涤。
作用： 洗涤步骤旨在清除未结合的蛋白质、盐类、细胞碎片和 PCR 抑制剂，确保纯化后的核酸高度纯净。
- 核酸洗脱： 经过充分洗涤后，洗脱缓冲液 (EB - Elution Buffer) 被加入。EB 提供一个特定的缓冲环境，促使纯化的核酸从磁珠表面解离并洗脱下来，形成高纯度的核酸溶液，为后续的 PCR 扩增做好准备。3
- PCR 扩增与荧光检测 (PCR Amplification & Fluorescence Detection)
- 加入主混合液： 纯化并洗脱出的核酸溶液被转移到 PCR 反应管中。自动化系统会加入主混合液试剂1 (MMX-R1) 和 主混合液试剂2 (MMX-R2)。
作用： MMX-R1 和 MMX-R2 共同构成了 PCR 反应所需的所有核心组分，包括针对 HIV-1、HIV-2、HCV、HBV 和内标 (IC) 的特异性引物和荧光探针，以及耐热 DNA 聚合酶、逆转录酶、dNTPs、缓冲液和辅助因子。
- 实时荧光定量 PCR 反应： 反应管进入 PCR 扩增模块，在精确控制的温度循环下，进行实时的逆转录-聚合酶链反应。
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2.3 荧光信号检测： 在扩增过程中，相应的荧光探针被分解，释放出荧光信号。系统会实时监测这些荧光信号的变化。荧光信号的累积强度和达到阈值所需的循环数 (Ct 值) 直接与样本中目标病毒核酸的初始拷贝数相关。
- 结果判读： 自动化系统会根据预设的阈值和算法，对实时荧光信号数据进行分析，自动判读每个样本是否含有 HIV-1、HIV-2、HCV 或 HBV 病毒核酸，并生成最终的定性或半定量结果。
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外部质控： 阳性质控品（MPX PC, HIV-1 O, HIV-2）和阴性质控品（NHP Negative Control）在每次检测批次中与患者样本一同运行。它们的检测结果用于验证整个系统（包括试剂、仪器和操作）是否正常工作，确保检测的准确性、灵敏度和特异性。
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