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Analisi quantitativa espressione genica - Coggle Diagram
Analisi quantitativa espressione genica
Studiare non solo traduzione mRNA, l’espressione dipende da + fattori: meccanismo trasporto mRNA, nucleo citosol, modifiche post traduzionali ed epigenetiche…
Considero la
gerarchia
Dna —> mRNA —> proteina controllo epigenetico
range dinamico
abbondanze proteiche rispetto a mRNA
Vekocità di trascrizione e traduzioe
limitate nei mammiferi
Metodi
Ibridazione in situ
Northen blot
Visualizzare e identificare RNA separato x elettroforesi, poi trasferito su una membrana, sfrutta ibridazione molecola RNA interesse +
sonda DNA complementare
informazioni quantitative qualitative RNA bersaglio campioni in esame. dopo lavati rimane RNA ibridato con sonda.
Saggi protezione RNasi
solo informazioni quantitative, maggiore sensibilità northen blot 1. clonare trascrivere
cDNA
complementare al gene studiato 2. sonda ibridata con mRNA totale prodotto da cellula 3. ibrido icubato con RNasi degrada singoli filamenti non ibridi 4. autoradiografia x quantificare trascritto rimasto
cDNA microarray
Marcare trascritto interesse
nucleotidi marcati
, cellule incorporano durante trascrizione. Aggiunti a 2 medium, 1 controllo antibiotico. Si estraggono ed isolano trascritti tramite
separazione x affinità
biotinilazione
, induce legae SH
tiouridina
e COOH biotina. legame biglie funzionalizzate streptavidina raccolta trascritto interesse
immunoprecipitazione
se marcati bromouridina
PCR
PCR
amplificare DNA di interesse, milioni miliardi di copie. in provetta assemblate.
denautrazione
94 °C,
annealing
2 primer vengono fatti appaiare a sequenze complemetnari,
allungamento
DNA pol replica regione che parte da dive è appaiato il primer
molecole DNA doppio filamento da stampo
2 oligonucleotidi primer sequenze delimitano regione DNA da amplificare
DNA polimerasi
4 tipi dNTP’s equimolari
tampone + MG2+
i
primer
si appaiano all’estremità 3’ eliche stampo. primer senso e primer antisenso.
i primer si appaiano estremità 3’ eliche stampo
primer forward
primer antisenso
caratteristiche primer:
lunghezza media 17-30 nt
temperatura melting 60-64°c differenza 2°C o meno
temperatura annealing non più bassa 5°C melting
contenuto GC 35-65% regioni con 4+ residuiG
Elevato grado di omologia filamenti DNA stampo, completa complementarietà 2-3nt 3’
estreità 3’ incidenti
singoli prime no sequenze complementari no strutture secondarie intramolecolari
no complementarietà reciproca no dimeri
Si possono usare diverse DNA pol tutte resistenti a diverse alte temperature
Taq polimerasi
no proof-reading in 3’-5’ bassa fedeltà altre alta fedeltà replicazione ma bassa efficienza Pfu DNA polierasi e Pwo DNA polimerasi. altre sono
hot start
attività solo post denaturazione iniziale
il numero finale di copie Y frammenti DNA amplificate da X copie con n cicli di PCR è Y=X(1+E)^2 (n-1) visto che i frammenti primo ciclo non considerati —>
curva iperbolica
si sovrappone baseline si stacca e aumenta esponenzialmente plateau. q DNA proporzionale numero cicli. frammenti visualizzati su elettroforesi + agenti intercalanti