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PCR- REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI - Coggle Diagram
PCR- REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI
PCR
FASI CICLICHE
:
2.ANNEALING (40–68°C): I PRIMER SI LEGANO ALLE SEQUENZE COMPLEMENTARI DA AMPLIFICARE / DURATA 30 SEC
3.ESTENSIONE (70–74°C): LA TAQ SINTETIZZA NUOVO DNA (DIREZIONE 5’→3’) / DURATA 60 SEC
1.DENATURAZIONE (94–95°C): SEPARA I 2 FILAMENTI DNA / DURATA 30 SEC
OGNI CICLO DURA CIRCA 1–2 MINUTI, E SI RIPETE X 25–40 CICLI.
TECNICA RIVOLUZIONARIA DEGLI ANNI ‘80 → È UNA TECNICA DI BIOLOGIA MOLECOLARE CHE PERMETTE DI AMPLIFICARE SPECIFICHE SEQUENZE DI DNA IN VITRO
RENDENDOLE VISIBILI E ANALIZZABILI ANCHE A PARTIRE DA POCHISSIME MOLECOLE.
THERMAL CYCLER
: STRUMENTO CHE REGOLA LE TEMPERATURE X OGNI FASE.
REAGENTI FONDAMENTALI
DNTPS
: BASI AZOTATE X LA SINTESI.
NOTA
: SE IL NUMERO DI CICLI È TROPPO ALTO, SI CONSUMANO INUTILMENTE I REAGENTI E SI RISCHIANO PRODOTTI NON SPECIFICI.
PRIMER
: BREVI SEQUENZE (MAX 29 BASI), CON CONTENUTO GC TRA 40-60% X EVITARE RIPIEGAMENTI O “SMESSI”.
BUFFER
: MANTIENE CONDIZIONI OTTIMALI X L’ATTIVITÀ ENZIMATICA.
DNA STAMPO
TAQ POLIMERASI
: ENZIMA RESISTENTE AL CALORE, OGGI DISPONIBILE IN VERSIONI + STABILI E RAPIDE.
STRUMENTAZIONE: TERMOCICLATORE
DISPOSITIVO DOTATO DI POZZETTI E PROGRAMMA DIGITALE X GESTIRE I CICLI TERMICI.
I CAMPIONI VENGONO INSERITI IN PROVETTE ALL’INTERNO DEL BLOCCO TERMICO.
CONTAMINAZIONE: COME EVITARLA
CAMBIARE PUNTALE TRA OGNI CAMPIONE.
ALIQUOTARE I REAGENTI (ES. DNTP): COSÌ, SE SI CONTAMINA UN’ALIQUOTA, NON SI COMPROMETTE L’INTERO STOCK.
LAVORARE IN CAPPA A FLUSSO LAMINARE.
USARE UN CONTROLLO NEGATIVO (BIANCO): PROVETTA CON TUTTI I REAGENTI TRANNE IL DNA. SE SI AMPLIFICA → CONTAMINAZIONE.
BUONE PRATICHE
EVITARE LO SCAMBIO DI PROVETTE.
MENO PASSAGGI E MENO APERTURE DI PROVETTE = MINORE RISCHIO DI CONTAMINAZIONE.
USARE MASCHERINA E GUANTI.
ANALISI DEI PRODOTTI: ELETTROFORESI SU GEL
VISUALIZZATI CON BROMURO DI ETIDIO (⚠️ CANCEROGENO!).
CONFRONTO CON UN MARKER (DNA CON FRAMMENTI DI LUNGHEZZA NOTA).
I FRAMMENTI AMPLIFICATI VENGONO CARICATI SU GEL DI AGAROSIO.
INTERPRETAZIONE
:
FRAMMENTI ASPECIFICI = “BANDERELLE” PICCOLE → POSSIBILE CONTAMINAZIONE O ERRORE NEI PRIMER.
APPLICAZIONI DELLA PCR
CONTROLLO DI TERAPIE ANTITUMORALI
DETERMINAZIONE DEL SESSO (ANALISI FORENSI, PRENATALE)
STUDIO DELL’ESPRESSIONE GENICA
SOUTHERN BLOT (FASE PREPARATIVA)
DIAGNOSI GENETICHE (ES. EMOFILIA)
STUDI EVOLUTIVI MOLECOLARI
DIAGNOSI BATTERICHE E VIRALI