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APOPTOSI 2 - Coggle Diagram

- - - - Più espressa perché la cellula tumorale non vuole morire
        
        E' una strategia messa in atto dalle cellule tumorali per garantirsi la sopravvivenza
        
        Rendere l'apoptosi più refrattaria
        
        La replicazione è aumentata insieme all'aumentata sopravvivenza delle cellule significa che il tumore inizia ad essere una neoplasia
        
        Però è chiaro che cercare una sequenza di un gene simile ad uno noto e definire che hanno la stessa attività ce ne corre
        
        Qual è l'omologia per cui ritengo che sia simile e faccia la stessa funzione? Non esiste. La devi provare.
  - - - È così che hanno fatto gli scienziati, hanno scovato gli antipoptotici partendo da sequenze note, le prime sequenze note, poi andando in banca dati e cercando quelle simili
- - - - e non è che per monitorare l'apoptosi andate a fare la microscopia elettronica, non ne uscite vivi.
- - - - Come si monitora?
        
        Ci sono delle molecole, una è questa annexina, annexina V, resa fluorescente, che è capace di interagire con il fosfolipide in questione, la fosfatidilserina
        
        Quindi abbiamo cellule in coltura
        
        Le mettiamo in eppendorf
        
        Ci mettiamo l'annexina V coniugata ad un fluorocromo
        
        Incubiamo
        
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- - - - riesce a tagliare il DNA linker tra i nucleosomi, quello libero, che si predispone meglio al taglio
        
        Per cui se non fate una digestione completa otteniamo frammenti di DNA lunghi 150bp e suoi multipli, quindi la famosa scaletta di DNA
        
        Nell'apoptosi questo avviene NATURALMENTE
        
        nelle fasi finali del processo apoptotico, si liberano nella cellula endonucleasi che vanno a tagliare la cromatina esattamente come fa la nucleasi micrococcale
        
        Quindi si estrae DNA genomico da cellule apoptotiche, e da altre cellule non trattate come controllo
        
        Corriamo il DNA di queste 2 popolazioni su gel
        
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        Il DNA si estrae con un detergente non ionico
- - - - flipping della fosfatidilserina
        
        Questo è tra i primi fenomeni che accadono in una cellula che sta iniziando in maniera irreversibile il processo apoptotico
        
        Con citometro, annexina V fluorescente, faccio una time-course e vedo a vari tempi, in maniera precoce, quando inizio a osservare il fenomeno
        
        È lì che inizio a quantizzare
        
        Se dopo 6 ore iniziano a morire cellule, io sono ragionevolmente convinto che tra le 6 e le 12 ore è un momento in cui posso definire quant'è l'apoptosi percentuale in quella popolazione senza essermi perso niente, perché prima non è successo nulla
        
        rendo veramente quantitativo lo studio
        
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    - - immaginate che io stia facendo un esperimento, invece che in vitro, testando molecole citotossiche, antitumorali, etc., lo faccio in vivo, in un topo in cui ho generato tumori e sto trattando o non trattando le popolazioni per capire se c'è un effetto terapeutico sulla massa tumorale :mouse:
        
        A volte si fanno le scannerizzazioni ai topi. Le cellule sono fluorescenti, tumorali, e tu scannerizzando in uno scanner a fluorescenza e vedi senza sacrificarli la massa tumorale quant'è.
- - - - Prelevi il tumore dal topo sacrificato, lo fissi in formalina, disidrati, includi in paraffina
        
        Questi tessuti così fissati possono essere studiati
        
        E a questo punto di può studiare la frammentazione del DNA
        
        Cioè se ci sono cellule in questa sezione di tessuto che nei topi trattati dimostrano di essere apoptotiche perché hanno il DNA frammentato, tu puoi concludere che l'effetto terapeutico è dato dal fatto che le cellule tumorali le hai indotte alla morte attraverso il processo apoptotico
        
        Un saggio che ci viene in aiuto è il TUNEL ASSAY
        
        Il presupposto è che ci sono delle estremità libere generate dalla frammentazione del DNA
        
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        fettina di tessuto tumorale: 3 micrometri di spessore
        
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- - - - sono proenzimi che vengono attivati ed eseguono praticamente l'apoptosi, cioè distruggono la cellula
      - Sono enzimi proteolitici
      - Le caspasi sono omologhe del CED3, originariamente pro-apoptotico scovato in C. elegans
        
        non solo l'omologia di queste proteine, ma anche il meccanismo attraverso il quale agiscono
        
        Cioè le cellule di C-elegance muoiono esattamente come muoiono le nostre per apoptosi
    - - Omologa del CED4
      - Fa parte della via intrinseca del processo apoptotico.