Please enable JavaScript.

Coggle requires JavaScript to display documents.

GEENITEKNIIKKA - Coggle Diagram

- - - - solut rikotaan kuumentamalla niitä emäksisessä liuoksessa
        
        tämän jälkeen DNA voidaan erottaa muista molekyyleistä esim. propanolin avulla
    - - DNA on solun tumassa, joten tuma jasitä ympäröivät solurakenteet pitää rikkoa mekaanisesti tai liuottamalla hapoilla
        
        tämän jälkeen solun sisältämät tärkeimmät biomolekyyliryhmät voidaan erottaa toisistaan kemiallisesti
      - myös mitokondriot ja viherhiukkaset sisältävät DNA:ta
        
        mitokondriaalinen DNA eristetään erottamalla ensin mitokondriot solumurskeesta sentrifugoimalla
        
        tämän jälkeen mitokondriot hajotetaan ja niistä eristetään DNA
        
        sama periaate viherhiukkasilla
      - haastavampaa, koska DNA:ta ympäröi tuma ja DNA on sitoutuneena useisiin kromosomin proteiineihin (histonit)
    - - lipidit (kalvorakenteet) rikotaan astianpesuaineella ja proteiinit (histonit yms.) rikotaan proteaasilla (entsyymi)
        
        uutetaan liuootimeen; saadaan proteiinit ja rasvat erilleen DNA:sta
        
        syntynyt liuos sentrifugoidaan DNA-vesi-kerroksen erottamiseksi
        
        DNA saostetaan kylmällä etanolilla tai propanolilla
        
        DNA kerätään pipetillä talteen jatkokäsittelyyn
  - - - syntyy yksijuosteiset "liimakohdat" eli hännät, jotka voivat yhdistyä automaattisesti uudelleen -> geenitekniikassa hyödyntäminen
        
        liittäjäentsyymi eli ligaasi yhdistää vielä DNA-pätkät toisiinsa -> muodostuu yhdistelmä-DNA-ta
      - cas-entsyymit = bakteerien katkaisuentsyymejä, joita ne käyttävät virusten eli bakteriofagien perimän katkomiseen (suojautuvat virusinfektioilta)
        
        eroavat muista katkaisuentsyymeistä siten, että entsyymissä on kiinni opas-RNA:ta, jonka mukaan entsyymi tunnistaa katkaistavan alueen
        
        opas-RNA:ta voidaan muokata niin, että Cas-entsyymi saadaan katkaisemaan DNA mistä vain halutusta kohdasta
  - - - restriktio- ja ligaasientsyymim avulla voidaan esim. yhdistää ihmisen ja bakteerin DNA:ta
  - - - hedelmöittymättömän munasolun tuman tilalle siirretään erilaistuneen solun tuma-> munasolu kehittyy alkioksi
      - myös kantasolukloonaus
        
        kloonit ovat perimältään täysin identtisiä
- - - - CRISPR-tekniikka
        
        solu korjaa Cas-entsyymin tekemän katkoksen ja liittää samalla katkaisukohtaan uuden geenin
        
        solu korjaa Cas-entsyymin tekemän katkoksen, mutta katkaisukohdasta häviää samalla muutamia nukleotideja; geeni vaurioituu ja lakkaa toimimasta
        
        perustuu bakteerien immuunipuolustusjärjestelmästä löydetyn katkaisuentsyymin, Cas-entsyymin, toimintaan
        
        voidaan käyttää DNA:n muokkaamiseen että geeninsiirtoihin
  - - - muut tekniikat:
        
        mikroinjektio (vain soluseinättömiin soluihin)
        
        geenipyssy (kerralla vain pieneen osaa yksilön soluista)
        
        haasteena epävarma käyttö: siirron kontrollointi hankalaa
        
        ammutut DNA-päällysteiset kultahiput eivät välttämättä osu soluihin; voivat myös vaurioittaa solurakenteita, jolloin solu kuolee
        
        DNA siirtyy viljelmässä satunnaisiin soluihin, ei kaikkii tai haluttuihin
        
        sähköpulssi eli elektroporaatio (solukalvo muuttuu läpäuisevämmäksi: reikiä)
        
        perustuu siihen, että sähköimpulssin avulla lipidikalvot saadaan hetkellisesti normaalia läpäisevimmiksi
    - - plasmidi
      - kosmidi
      - muunneltu virus
      - agrobakteeri
        
        haasteena epävarma käyttö: siirron kontrollointi hankalaa
        
        infektoi vain osan soluista (mekaanisesti vaurioituneet)
      - keinotekoinen kromosomi
      - liposomi
  - - - vektoriin liitetään: siirrettävä geeni tai DNA-jakso, jokin merkkigeeni (esim. antibiootti)
        
        -> plasmidittomat solut kuolevat
        
        hengissä selviävät vain ne bakteerit, joissa geeninsiirto on onnistunut
  - - - intronien poisto (cDNA) ja toimivan säätelyalueen liitto
      - geenin siirto plasmidin, keinotekoisen kromosomin (BAC) tai bakteriofagin avulla
      - kasvatus maljoilla tai bioreaktoreissa (esim. geenikirjastot)
    - - geenin siirto yhdistelmäplasmidin avulla
      - kasvatus maljoilla tai bioreaktoreissa
    - - geenin siirto agrobakteerin avulla tai geenipyssyllä = ammutaan DNA:lla päällystettyjä kultahippusia soluihin
      - soluseinättömien kasvisolujen eli protoplastien yhdistäminen sähköpulssilla, tällöin myös mikroinjektio ja liposomi mahdollisia vektoreita
- - - - ELEKTROFOREESI
        
        eri pituiset DNA-palaset saadaan eroteltua toisistaan (yleensä halutaan tutkia vain tietty osa)
        
        PCR:llä monistettua DNA:ta pipetoidaan geelin koloihin
        
        geeliin luodaan elektrodeilla sähkökenttä
        
        näytteet liikkuvat kohti positiivista päätä
        
        pitkät DNA.pätkät kulkevat geelillä hitaammin kuin lyhyet
        
        DNA- pätkä saadaan näin eroteltua koon perusteella toisistaan !!myös etsitty geeni!!
        
        geelistä leikataan haluttu DNA-jakso irti jatkokäsittelyä varten
      - PCR-TEKNIIKKA (polymeraasiketjureaktio)
        
        = monistetaan DNA:ta tutkimusta varten
        
        1) eristetään pieni määrä DNA:ta solukosta tai kudoksesta
        
        2) valitaan alukkeet, joiden avulla rajataan monistettava geeni tai DNA-jakso (aluke = lyhyitä synteettisiä DNA-pätkiä)
        
        3) pipetoidaan koeputkeen: eristetty DNA, alukkeet, DNA-polymeraasientsyymiä, kaikkia irrallisia nukleotideja (A, T, C, G)
        
        4) seos laitetaan PCR-koneeseen
        
        7 more items...
        
        huomattavasti nopeampi kuin DNA:n kloonaaminen
    - - KOETIN
        
        = koetin on synteettinen, lyhyt yksijuosteinen DNA-pätkä, joka liittyy emäspariperiaatteen mukaisesti etsittävään geeniin
        
        synteettinen = laboratoriossa valmistettu
        
        täytyy tietää edes osa etsittävän geenin emäsjärjestyksestä geenin alusta
        
        KOETINHYBRIDISAATIO
        
        koettimen käyttö perustuu siihen, että jos tutkittava DNA-näyte sisältää koettimen sekvenssiä vastaavan sekvenssin, koetin pariutuu näytteessä olevan yksijuosteisen DNA-molekyylin kanssa
        
        jos koetin sisältää leiman, se aktivoituu hybridisaatiossa ja lähettää signaalin, joka voidaan havaita ja rekisteröidä tähän tarkoitetulla laitteella
  - - - 1) sekvensoitavan genomin kopioita alussa
        
        2) genomi pilkotaan useiksi lyhyiksi jaksoiksi, jotka sekvensoidaan erikseen
        
        3) päällekkäistein sekvenssien avulla jaksot järjestetään oikeaan järjestykseen
        
        4) lopullinen sekvenssi on muodostunut
  - - - DNA:ta on helppo varastoida bakteerien plasmideihin geenikirjastoiksi
    - - cDNA-kirjasto: vain geenien lähetti-RNA:t siirretty, ei koko perim''
        
        = silmukoidusta lähetti-RNA:sta tehty kirjasto, ei sisällä introneja, promoottoreita eikä säätelyalueen muitakaan osia
      - = bakteeriviljelmä, jossa jokaisella bakteerilla on eliön yhden geenin vastin-DNA
    - - = bakteeriviljelmä, jossa jokaisella bakteerilla on joku jakso eliön genomia
  - - - etsitään näytteestä tiettyjä geenejä
      - kun sirun pinnalle levitetään DNA-näyte, voidaan sirulla nopeasti etsiä esim. merkkejä perinnöllisiä sairauksia aiheuttavia geenejä
    - - 2) annetaan hybridisoitua DNA-sirussa kiinni olevien ja eri geeneistä peräisin olevien yksijuosteisten DNA-palasten eli koettimien kanssa
        
        3) lopulta nähdään, mitä kaikkia lähetti-RNA-molekyylejä solussa on ollut, eli mitä geenejä eristyshetkellä eli näytteenottohetkellä solussa ilmennettiin
- - - - saadaan yksilöille ja lajeille uusia ominaisuuksia esim. tehokkaampi proteiinien tuotanto
  - - - estetään koe-eläimillä tai soluviljelmissä jonkin geenin toiminta
        
        sairuaden tutkiminen eli mallinnus tautimalleilla
- - - - monoklonaalinen vasta-aine = tietty spesifinen vasta-aine, joka tunnistaa tarkasti vain yhden antigeenin
        
        valmistus:
        
        1) hiiren verenkiertoon ruiskutetaam antigeenejä
        
        2) hiiren valkosoluja eristetään
        
        3) valkosolut fuusioidaan myeloomasolujen kanssa
        
        4) fuusioituja soluja viljellään
        
        1 more item...
  - - - rokotteisiin tarvittavia taudinaiheuttajaviruksia ja -bakteereja viljellään soluviljelmissä
        
        tämän jälkeen taudinaiheuttajat tapetaan tai heikennetään erilaisilla käsittelyillä tai niistä otetaan talteen molekyylejä, jotka laitetaan rokotteeseen
    - - rokotteissa on yhtä tai useampaa taudinaiheuttajan molekyyliä, joka toimii kehossa antigeenina
      - uusimmissa rokotteissa on vain taudinaiheuttajan perimän osa, joiden avulla kehon solut valmistavat antigeenia
      - rokote saa elimistössä aikaan vasta-aineiden ja muistisolujen muodostumisen
  - - - in vivo -menetelmä
        
        hoitava geeni siirretään jollakin vektorilla suoraan potilaan kudoksiin
      - ex vivo -menetelmä
        
        hoidettavat solut käsitellään soluviljelmässä, jonka jälkeen ne palautetaan potilaan kehoon
    - - vektorina esim. virus tai liposomi
      - ongelmia: kallista, geenin mahdollinen kiinnittyminen väärään kudoksen, vektorien tehottomuus ja siirretyn geenin toiminnan loppuminen
      - muutos ei saa olla periytyvä (laki)
  - - - siirrettävät solut voivat olla geenitekniikan avulla valmistettuja pluripotentteja kantasoluja eli iPS-soluja
        
        iPS-solujen kehittäminen ja käyttö
        
        nämä solut ovat jostakin kudossolusta muokattuja pluripotentteja kantasoluja, jotka voidaan edelleen saada erilaistumaan useiksi eri solutyypeiksi
        
        voidaan valmistaa potilaan omista soluista (esim. sidekudoksesta)
        
        kun solut ovat erilaistuneet, niitä voi käyttää potilaiden hoidossa tai myös tutkimuksessa tautimalleina
        
        soluviljelmässä niihin siirretään sopivan vektorin avulla tiettyjen säätelyproteiinien geenit -> tämä saa solut kehittymään iPS-soluiksi, jotka voidaan edelleen erilaistaa haluttuun suuntaan
        
        tärkeitä myös sairauksien tutkimuksessa
        
        tautimallina (= soluviljelmä, jossa ilmenee jonkin ihmiselle tyypillisen sairauden ominaisuuksia)
        
        KANTASOLUJEN KÄYTTÖ
        
        kantasolu = erilaistumaton solu, joka pystyy erilaistumaan miksi tahansa aikuisen yksilön solutyypiksi
        
        voi erilaistaa eri kudosten soluja:
        
        tautimallit
        
        sairaanihmisen toimimattomien kudosten korvaus
        
        potilaan omat kantasolut (iPS-solu)
        
        hoidollinen kloonaaminen
      - esim. leukemian hoidossa käytetään
- - - - valintajalostus (perinteinen jalostus)
        
        populaatiossa jo olemassa oleva ominaisuus yleistyy ja muut ominaisuudet vähenevät -> syntyy jalostuslinja
        
        populaation geenivarasto ja monimuotoisuus muuttuu ja köyhtyy
        
        ihminen valitsee parhaimmat yksilöt lisääntymään
      - risteytysjalostus
        
        yhdistetään useita samassa lajissa jo olevia hyviä ominaisuuksia keskenään, eli kahden eiri jalostuslijan yhdistys
        
        risteytetään saman lajin kaksi erilaista yksilöä -> hybridi
        
        jälkeläiset ovat heterotsygoottisia, mikä voi lisätä elinvoimaa -> risteytysvoimaa eli heteroosia
  - - - muodostuvat yksilöt ovat alkuperäisen kasvin klooneja
        
        jokaisesta solusta saadaan kasvamaan uusi kokonainen kasviyksilö kasvihormonien avulla
  - - - ei siis lisätä genomiin vierasta geeniä
      - muokkaus tehdään usein CRISPR-tekniikalla
        
        nopeaa ja tarkkaa verrattuna perinteisiin jalostusmenetelmiin
- - - - suomalaisten genomit hyvin samanlaisia
        
        Suomen sisällä itäinen ja läntinen ryhmä
      - aiheuttajana usein pistemutaatiot
  - - - käytetään PCR:ää
      - yksilön voi tunnistaa myös: sormenjäljistä, ruumiinrakenteesta, nenän muuodosta, pituudesta, ihonväristä sekä kätisyydestä