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Produção In Vitro de Embriões (PIVE) na Medicina Veterinária
OPU: Aspiração Folicular para coleta de oócitos imaturos
Procedimento de aspiração
Inserção da probe transvaginal com guia de agulha, visualização dos folículos por ultrassonografia e aspiração sequencial
Posicionamento da doadora
Contenção adequada do animal e higienização da região perineal para evitar contaminações
Preparação do equipamento
Montagem do sistema de aspiração com agulha especial, linha de aspiração, filtro coletor e bomba de vácuo calibrada com pressão de 80-120 mmHg
Transferência de material
Transporte do filtro com líquido folicular para o laboratório em meio tamponado a 37°C
CLASSIFICAÇÃO: Seleção dos oócitos viáveis para maturação
Grau 3
Oócito com cumulus parcialmente desnudo ou com células expandidas
Irregular
Grau 2
Oócito com 1-3 camadas de células do cumulus, ligeiramente expandido
Boa
Grau 4
Oócito desnudo ou com cumulus escuro, irregular
Ruim
Grau I
Oócito com cumulus compacto e mais de 3 camadas de células
Exelente
Maturação In Vitro (MIV): Preparando para a Fertilização
Meio de maturação
TCM-199 suplementado
Soro fetal bovino (10%)
FSH/LH (0,5ug/ml)
Estradiol
Piruvato e antibiótico
Condição de incubação
Temperatura 38,5°c
Umidade: Saturada
Atmosfera: 5% CO2 em ar
PH do meio: 7,2-7,4
Tempo: 22-24 horas
Objetivo da maturação
Retomar a meiose
Progressão até metáfase II
Expansão dos cumulos
Maturação citoplasmática
Capacitação para a fertilização
MIV: Fatores que Influenciam o Sucesso
Tempo de precisão
A duração da IVM de 22-24h é crítica. Tempo insuficiente leva à maturação incompleta, enquanto tempo excessivo causa envelhecimento oocitário
Volume do meio
Razão ideal de 10μl/oócito para equilíbrio entre diluição de metabólitos e concentração de fatores parácrinos
Controle térmico
Flutuações de temperatura afetam negativamente o citoesqueleto e a organização cromossômica
Composição do meio
Hormônios, fatores de crescimento e antioxidantes melhoram as taxas de maturação
Fertilização In Vitro (FIV): Unindo Gametas
Preparo do sêmen
O sêmen congelado passa por processos de seleção espermática para separar espermatozoides viáveis e remover o diluente e plasma seminal.
Técnicas utilizadas
Gradiente de Percoll (45%/90%)
Swim-up em meio capacitante
Centrifugação (700g por 10min)
Métodos de FIV
FIV convencional
Co-incubação de oócitos e espermatozoides
Processo simples e de baixo custo
Seleção natural dos espermatozoides
ICSI (menos comum em bovinos):
Injeção direta de um espermatozoide
Útil para sêmen de baixa qualidade
Requer equipamento especializado
FIV: PROCESSO DE FERTILIZAÇÃO
0 HORAS
Oócitos maduros são colocados em gotas de meio de fertilização
1 A 2 HORAS
Espermatozoides capacitados são adicionados às gotas contendo os oócitos
6 A 8 HORAS
Ligação e penetração do espermatozoide na zona pelúcida
12 A 8 HORAS
Formação dos pronúcleos masculino e feminino
18 A 20 HORAS
Singamia e início da primeira clivagem
Cultivo Embrionário In Vitro (CIV): Desenvolvimento Inicial
7- 8 DIAS DE CULTIVO
Período necessário para o desenvolvimento até o estágio de blastocisto
39,5° C TEMPERATURA IDEAL
Mantida constantemente durante todo o período de cultivo
5-6% CONCENTRAÇÃO DE CO2
Necessária para manter o pH adequado do meio de cultivo
5% CONCENTRAÇÃO DE O2
Ambiente de baixo oxigênio similar ao trato reprodutivo
Classificação Embrionária: Critérios Detalhados
GRAU I ( EXELENTE)
Massa embrionária simétrica e homogênea, com células de tamanho uniforme. Sem irregularidades ou extrusões. Coloração clara e zona pelúcida intacta.
MCI compacta e bem definida. TE com células uniformes formando epitélio coeso. Mais de 85% das células viáveis
GRAU 2 ( BOM)
Irregularidades moderadas na massa embrionária, com pequenas extrusões ou alguns blastômeros degenerados. Pequenas vesículas
MCI menos compacta. TE com pequenas irregularidades. Aproximadamente 50-85% das células viáveis.
GRAU 3 ( REGULAR)
Irregularidades moderadas na massa embrionária, com pequenas extrusões ou alguns blastômeros degenerados. Pequenas vesículas
MCI pequena ou difícil de identificar. TE com irregularidades evidentes. Apenas 30-50% das células aparentemente viáveis