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PRACTICA 8 MICROBIOLOGIA DE PESCADOS Y MARISCOS - Coggle Diagram
PRACTICA 8 MICROBIOLOGIA DE PESCADOS Y MARISCOS
Siembra de placas PETRIFILM
Aplicar ligera presión con el aplicador correspondiente, suavemente una vez depositada la dilución.
Incubar por 24 - 48 hrs y realizar el conteo conforme a la guía de interpretación.
Transferir 1.0 ml de la dilución correspondiente a la placa PETRIFILM para S. aureus, iniciando con la dilución más alta. Cuidar que sea depositado suavemente con la pipeta en posición perpendicular y en el centro de la placa.
IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS POR EL SISTEMA MICROSCAN
Fijar la micropipeta múltiple a la tapa
Ingresar la información de los pozos positivos en el sistema LabPro para microscan para la obtención de al menos el género bacteriano.
Abrir un frasco del diluyente y vaciarlo en la charola acanalada
Llevar a cabo la extracción del diluyente y vaciarlo en la placa de identificación MicroScan
Con el asa tomar 3 o 4 colonias aisladas, cuidando de no perforar o rayar el agar y hacer una suspensión bacteriana en un tubo con 3 ml de SSF.
Adicionar con pipeta estéril una gota de la suspensión bacteriana en cada uno de los pozos de pruebas bioquímicas de la placa de identificación de MicroScan
Realizar tinción de Gram (para seleccionar el panel a inocular adecuado)
En la placa inoculada existen algunos pocillos cuyos nombres se encuentran subrayados, a los cuales se les adicionaran tres gotas de aceite mineral a cada uno
Sembrar por estría cruzada una colonia aislada en el agar TCBS en agar TSA (al 2% de sal) e incubar de 18 a 24 hrs. De 30 a 32°C
colocar una tapadera e incubar de 30 a 32 °C por 24 hrs
Del macerado original hecho con la muestra de mariscos, sembrar por estría cruzada en una caja de Petri con agar TCBS adicionado con 2% de sal, e incubar por 24-48 hrs. De 30 a 32 °C.
Para realizar la lectura, es necesario adicionar algunos reactivos en pocillos específicos, indicados en la tabla de interpretación
PARA GRAM POSITIVOS
Adicionar al pozo PYR 2 gotas de peptidasa
Adicionar al pozo VP 1 gota de KOH y 1 gota de alfa-naftol
Comprobar la hemólisis de la bacteria
Adicionar al pozo NIT 1 gota de ácido sulfanilico y 1 gota de N,N-dimetil
PARA GRAM NEGATIVOS
Adicionar al pozo TDA 1 gota de Cloruro férrico
Adicionar al pozo NIT 1 gota de ácido sulfanilico y 1 gota de N,N- dimetil
Adicionar al pozo VP 1 gota de KOH y 1 gota de alfa-naftol
Adicionar al pozo IND 3 gotas de reactivo de Kovacs
Realizar la prueba de oxidasa a la bacteria en una tira reactiva
Lectura e Interpretación de resultados en placas simplate
En presencia de su maestro y con la luz apagada, colocar el plato bajo luz UV 15-30 cm de alto y hacer el recuento de los pocillos que presentan fluorescencia azul (E. coli)
Para determinar la concentración por plato, ejecute los siguientes cálculos
Utilice la tabla de conversión Simplate para determinar el número total de microorganismos por plato (separadamente para bacterias aerobias, hongos y levaduras, coliformes totales y E.coli.
Multiplique por el factor de dilución.
. Cuente el número de pocillos positivos en el plato
Cuente el número de pocillos que tengan un cambio de color respecto al color original. El cambio de color producido por coliformes totales es de naranja a rojo escurro.
Formula tu discusión y conclusiones.
Después de incubar, observe el cambio de color del líquido en los pocillos. No le ponga atención a las partículas presentes.
PREPARACION DE LA MUESTRA.
Se colocarán los pedacitos de pescado en el mortero y se procede a macerar la muestra adicionando 45 ml de agua peptonada.
Una vez macerado, dejar reposar para colectar el líquido sobrenadante.
La muestra a preparar será de aproximadamente 5 g.
Tomar 1 ml del sobrenadante para realizar 4 diluciones decuples. Estas se realizarán bajo estrictas condiciones de esterilidad. Se recomienda el uso de perilla.
Se realizarán cortes a diferentes trozos de pescado colocados en una charola sin alejarse del mechero y con las pinzas y tijeras previamente flameadas con alcohol al 70 %.
Homogenizar cada tubo de dilución antes de proceder a realizar la siguiente dilución.
El alumno asignado para la toma de muestra y su preparación se colocará guantes.
Para realizar los conteos microbiológicos se considerarán únicamente las últimas 2 diluciones. (10 3 y 10 4).
No preocupase si algunos pocillos están parcialmente llenos. Los pocillos que estén parcialmente llenos del líquido serán positivos si hay presencia de bacterias viables. Evitar el uso excesivo de fuerza al golpear para evitar que el líquido entre en contacto con la tapa.
Presionando ligeramente la tapa contra el plato en cualquier lado de la cavidad de la esponja vaciar el exceso de medio. Inclinar el plato hacia usted para permitir que la esponja absorba el líquido. Observe el color base de los pocillos. Este color base es la mezcla de medio y muestra dentro de los pocillos.
Invierta el dispositivo SIMPLATE. Incubar de 24 a 48 horas a 37°C± 1°C
Siembra de la Prueba 1, 2 de Salmonella
Tomar 3 asadas del cultivo e inocular la prueba 1,2 en su extremo de tapón de rosca negro de baquelita y agregar 2 gotas de reactivo de yodo. En el otro extremo, de tapón blanco, agregar una gota del antisuero específico para Salmonella y recortar con tijeras flameadas la punta interna del tapón
Incubar por 24 hrs.
Incubar por 24 hrs a 37°C.
Resultados e interpretación: Observar si hubo crecimiento y la formación de líneas de precipitación.
Inocular el tubo de caldo glucosado con el sobrenadante restante del mortero.
Para la preparación de la cuenta de bacterias
Se agregara 1ml de la dilución 103 al medio de cultivo
SIMPLATE para hongos y levaduras (color)
SIMPLATE para coliformes y E. coli . (color)
SIMPLATE para bacterias aerobias (color)
Y homogenizar perfectamente hasta suspender el medio.
Es decir, se agregara 1ml de la dilución 104 al medio de cultivo Y homogenizar perfectamente hasta suspender el medio .
SIMPLATE para hongos y levaduras (color)
SIMPLATE para coliformes y E. coli . (color)
SIMPLATE para bacterias aerobias (color)
Retirar la tapa de la placa SIMPLATE y vaciar la solución medio/muestra en el centro de la placa. Cerrar la placa.
Transferir 1.0 ml de la dilución correspondiente al frasco que contiene el medio. El volumen final dentro del frasco debe de ser de 10ml ± 0.2ml. agitar para disolver el medio totalmente.
Sobre una superficie plana agitar suavemente en círculos con el fin de distribuir la mezcla del medio y la muestra en todos los pocillos. El plato puede ser tomado con las dos manos para inclinarlo ligeramente y así ayudar a distribuir el líquido en los pocillos.
Hidratar el medio de cultivo en 9.0ml de agua peptonada
Si es necesario, golpear suavemente sobre la mesa para eliminar las burbujas de aire que se hayan quedado en los pocillos.