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Bioensayo en ratones para detectar toxina botulínica en alimentos, Otros…

- - - - Inocular 2 tubos de medio de cultivo de carne cocida con 1-2 g de alimento sólido o 1-2 ml de alimento líquido por cada 15 ml de caldo de enriquecimiento. Incubar a 35 °C
        
        Inocular 2 tubos de caldo TPGY como se indicó anteriormente. Incubar a 28 °C.
        
        Después de 5 días de incubación, examine los cultivos de enriquecimiento. Verifique la turbidez, la producción de gas y la digestión de las partículas de carne. Observe el olor.
    - - Examine los cultivos microscópicamente mediante frotis húmedo o un frotis teñido con reactivo de Gram. Observe la morfología de los organismos y note la existencia de células clostridiales típicas, la aparición y extensión relativa de la esporulación y la ubicación de las esporas dentro de las células. Una célula clostridial típica se parece a una raqueta de tenis.
        
        Analice cada cultivo de enriquecimiento para detectar la toxina
        
        Si el cultivo de enriquecimiento no muestra crecimiento a los 5 días, incube 10 días adicionales para detectar una posible germinación tardía de las esporas dañadas antes de descartar la muestra como estéril.
      - Aislamiento de cultivos puros
        
        Agregue un volumen igual de alcohol absoluto esterilizado por filtración a 1 o 2 ml de cultivo de enriquecimiento en un tubo con tapa de rosca estéril. Mezcle bien e incube 1 h a temperatura ambiente. Para aislar de la muestra, tome 1 o 2 ml de la porción retenida y agregue un volumen igual de alcohol absoluto esterilizado por filtración en un tubo con tapa de rosca estéril. Mezcle bien e incube 1 h a temperatura ambiente.
        
        Con un asa de inoculación, sembrar 1 o 2 asas llenas de etanol o cultivos tratados térmicamente en agar hígado-yema de huevo de ternera o en agar anaeróbico de yema de huevo (o ambos) para obtener colonias aisladas. Si es necesario, diluir el cultivo para obtener colonias bien separadas. Secar bien las placas de agar antes de usarlas para evitar la propagación de las colonias. Incube las placas sembradas a 35 °C durante aproximadamente 48 h en condiciones anaeróbicas.
        
        Selección de colonias típicas de C. botulinum
        
        Seleccione alrededor de 10 colonias típicas bien separadas, que pueden ser elevadas o planas, lisas o rugosas. Las colonias comúnmente muestran cierta extensión y tienen un borde irregular.
        
        Utilice un asa de transferencia estéril para inocular cada colonia seleccionada en un tubo de caldo estéril. Inocule C. botulinum tipo E en caldo TPGY. Inocule otros tipos de toxinas de C. botulinum en caldo de hígado picado o medio de carne cocida. Incube como se describe anteriormente durante 5 días.
        
        Volver a sembrar el cultivo tóxico por duplicado en medio de agar yema de huevo. Incubar una placa anaeróbicamente a 35 °C. Incubar la segunda placa aeróbicamente a 35 °C. Si se encuentran colonias típicas de C. botulinum solo en la placa anaeróbica (no hay crecimiento en la placa aeróbica), el cultivo puede ser puro.
        
        Preparación de la muestra de alimentos
        
        Cultivar una porción de la muestra para detectar C. botulinum viable y retirar otra porción para realizar pruebas de toxicidad, almacenar el resto en el refrigerador. Centrifugar las muestras que contienen sólidos suspendidos bajo refrigeración y utilizar el líquido sobrenadante para el ensayo de toxinas. Extraer los alimentos sólidos con un volumen igual de buffer de gel-fosfato, pH 6,2, macerando el alimento y el tampón con un mortero previamente enfriado. Centrifugar la muestra macerada bajo refrigeración y utilizar el líquido sobrenadante para el ensayo de toxinas.
        
        Si están presentes toxinas de tipo no proteolítico, es posible que sea necesario activarlas con tripsina para detectarlas. Por lo tanto, trate una parte del líquido sobrenadante de alimentos, del alimento líquido o del cultivo de TPGY con tripsina antes de realizar la prueba de toxina. Incubar la preparación tratada con tripsina a 35-37 °C durante 1 hora con agitación suave ocasional.
        
        Pruebas de toxicidad
        
        Realice pruebas paralelas con materiales tratados con tripsina y duplicados sin tratar. Diluya una porción de líquido o cultivo de muestra sin tratar a 1:5, 1:10 y 1:100 en tampón de gel-fosfato. Haga las mismas diluciones de cada líquido o cultivo de muestra tripsinizado. Inyecte a cada uno de los pares separados de ratones por vía intraperitoneal 0,5 ml de líquido sin diluir sin tratar y 0,5 ml de cada dilución de muestra de prueba sin tratar.
        
        Repita este procedimiento con muestras duplicadas tratadas con tripsina. Caliente 1,5 ml de líquido o cultivo sobrenadante sin tratar durante 10 min a 100 °C. Enfríe la muestra calentada e inyecte a cada uno de los pares de ratones 0,5 ml de líquido sin diluir. Estos ratones no deberían morir, porque la toxina botulínica, si está presente, se inactivará con el calor.
        
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