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Méthodes d'Etude - Coggle Diagram
Méthodes d'Etude
Techniques
non morphologiques
Cytométrie en Flux = FACS
Principe
différencier les cellules marquée ou non par des anticorps fluorescents
Compter les cellules
Fonctionnement
anticorps marqués par fluorescence = antigène intracellulaire ou membranaire
laser excite fluorochrome
dispositif affecte charge négative au cellule fluorescentes puis les trie
Résultat
Quantification et tri cellulaire de mol a interieur ou en surface de la cellule
pas de localisation
Fractionnement Subcellulaire
Principe
Séparation des differents constituants = vitesse sédimentaire grace a une succession de centrifugation durant 1 temps déterminés avec accélération croissante
Fonctionnement
un gradient de concentration
force centrifuge = les composants cellulaires les plus lourds sédimentent au fond du tube
1er = (10 min 1000g) noyaux + débris cellulaires / organites + membrane
2eme = (20 min 20 000g) mitochondries + peroxysomes + lysosomes
3 eme = (60 min 80 000g) microsome / cytosol
Application
Etude biochimique sur compartiment de la cellule (structure + fonction)
ELISA
Fabrication d'Anticorps Monoclonaux
Def= produit grâce au lymphocytes B activé qui reconnaissent le même épitope d'un antigène
Technique d'Hybridome
Prélèvement de la rate = lumphocytes B
fusion avec des cellules myélomateuses
cellules lymphocytes B + myélome
Sélection des clones produisant l'anticorps monoclonal
production d'anticorps in vitro
Application = utiliser pour permettre une réaction spécifique
Principe
conceptualisé par 2 suédois en 70
Test immuno-enzymatique = réaction antigène-anticorps grace a une réaction colorée produite (substrat d'une enzyme fixe par anticorps secondaire)
Avantage = accessible, matériel facile, technique très sensible, tester un grand nombre d'echantillon
Inconvénients = limite détection, dépend paramètre
Résultat
Dosage d'un antigène ou anticorps
concentration sériques d'anticorps
ELISA Indirect
Dosage d'un anticorps
Protocole
antigène spécifique de l'anticorps recherché
2 anticorps au dessus et deuxième permet d'identifier
ELISA Sancwich
Dosage d'un antigène
Protocole
anticorps spécifique de l'antigène recherché
1 anticorps au dessus (permet d'identifier) et 1 anticorps en dessou
Chromatographie
Principe
séparation d'un mélange de mol
2 phases = mobile (liquide+mélange mol) ; fixe (papier+gel+cellulose)
Chromatographie sur gel ou exclusion
colonne remplie de billes poreuses formant un gel
mol = vitesse diff selon leur taille
Chromatographie d'affinité
ayant une affinité spécifique pour la mol d'intérêt contenu dans la phase mobile
Resultat
purification d'une mol
sur gel = taille
d'affinité = affinité spécifique
échangeuse d'ion = charge
Eléctrophorèse
Principe
Dénaturation des protéine
Migration sur gel SDS-PAGE = gel polyacrylamide
Fonctionnement
Dénaturation par chauffage + détergent SDS afin de charger négatif
Migration des protéine vers le pole positif
Migration selon poids moleculaires
Transfert sur feuille de nitrocellulose = Western Blot
Résultat
Séparation par poids moléculaire = petites migrent plus vite
Estimation du poids moléculaire grâce au témoin
Indication sur la quantité de protéine = proportionnelle a la largeur des bandes colorés par le bleu de Coomassie
Techniques
morphologique
/ imagerie cellulaire
Microscope : Description
morphologiques
des structures
Résolution d'un microscope :
Def = plus petite distance que l'on observe entre 2 points sans les confondre ; plus elle est petite --> plus le microscope est fort
Formule =
D = (0,61λ)/N sin α
indice de réfraction influe sur la résolution
Air = 1
Huile = 1,5
D oeil = 0,2 mm
sin α = meilleure angle 70° pour MO
Différents échantillons :
Cellule vivantes
Millieu de culture = boite de pétri (cellule adherente) ou tubes (cellule non adherente)
Condition de culture = incubation 37°C + atmosphère humine (5% CO2) + asepsie + milieux de culture spécifique au cellule (+facteur de croissance)
2 types de cellules = primaire (organe+pop polymorphe) ; secondaire (repiquage+pas de differenciation)
Echantillons cellulaires
Liquides biologiques = sang, urine, moelle hématopoïétique, liquide céphalo-rachidien
Liquides pathologique = épanchement de la plèvre, péritoine, articulation
Liquides d'exploration = lavage broncho-alvéolaire
Brossages ou grattage = frottis vaginal
Echantillons tissulaires
Biopsies = ganglions
Morceaux de biopsies
Imagerie cellulaire
Description morphologique = réalisation de coupes et observation en MO ou ME
Etudes in situ des constituants d'une cellule = localisation par Histochimie ou Histoenzymologie (sucres, lipdes, enzymes, lysosomes, Ac nucleiques,...)
Analyse moléculaire in situ = Immunohistologie (proteine), Hybridation in situ (Ac nucléique), Autoradiographie (macromolécules)
Préparation des coupes
Rapidement par la fixation par le froids après congelation
Congélation = azote -196°C + cryoprotecteurs (limiter cristaux de glace)
Insertion dans cryostat = enceinte réfrigérée -20 a -30°C + microtome (coupe 5-10µm)
Observation MO (coloration)
Préparation plus longue avec fixation chimique
Agents chimiques = stabiliser (+coupe plus fine et dure longtemps)
Protocole de préparation
Figer les structures biologiques (similaire etat naturel)
Remplacement de l'eau par des solvants organiques
Remplacement du solvant par le matériel d'inclusion
coupes = microtome+coloration (MO) ; ultra-microtome+contraste(MET)
Microscope
MO
Microscope Photonique Classique
Principe
photons
lentilles de verre = condenseur, objectif et oculaire
grossissement 400 - 1000 x
Préparation
Fixation = formaldéhyde, glutaraldéhyde
Déshydratation + inclusion = paraffine (55-60°C --> durcit 20-25°C)
Coupe = 5µm
Dépôts sur lame de verre, réhydratation
Coloration = Eosine (violet=cytoplasme) ; Hémalun (violet foncé=noyau)
Résultat
Résolution =0,2µm
forme, aspect de la cellule, noyau
Microscope a Contraste de Phase
Principe
déviation des rayons lumineux = déphasage
pas déviation = brillance
déviation = peu brillance
Image en niveau de gris
Préparation
pas de préparation
pas fixation, pas coupe, pas coloration
Résultat
organisme vivant + déplacement
Microscope a Fluorescence
Principe
MO avec lampe UV + 2 filtre (excitation + arret)
détecte la lumiére emise par mol fluorescentes après excitations
2 lampes (halogène+arc vapeur mercure)
Préparation
marquage anticorps + fluorochrome (Fluorescéine vert / Rhodamine rouge)
Résultat
Localisation de mol marquées sur fond noir
λ1<λ2
observation détaillé des structures
Microscope Confocal
Principe
1988
un faisceau laser (fluorescence)
coupes optiques (ordre µm) = Image 3D
Préparation
Marquage anticorps + fluorochrome
Analyser échantillon epais
Résultat
localisation précise des mol
échantillons 20-100 µm
plusieurs lumières = plusieurs marquage
3D
ME
Microscope Electronique a Transmission = MET
Principe
électrons
lentilles ou bobines électromagnétiques
électrons frappe écran recouvert de mol fluorescentes qui émettent des photons = image (jaune ou noir-blanche)
Préparation
Fixateur chimiques = Formaldéhyde ou formol + Glutaraldéhyde + Tétraoxyde d'osmium
Déshydratation + inclusion = résine plastique (60°C)
Coupe ultramince avec un ultramicrotome = 50nm
dépot sur grille (diamètre 2mm) de cuivre ou platine
Agents contrastant = métaux lourds (Acétate d'uranyle + Citrate de plomb)
Résultat
Résolution = 0,1 - 2 nm
30 000 a 100 000 x
ultrastructure ou infracellualires visibles
échantillon fixé et mort
Microscope Electronique a Balayage = MEB
Principe
électron balaye surface de l'échantillon recouvert par un métal
Préparation
Fixation et déshydratation
Pas de coupe = échantillon entier
Métallisation = métaux (carbone ou platine)
Résultat
observation surface des échantillons
mort
Etude Constituant Biochimiques
Histochimie
Principe
Ajout réactif --> réaction chimique --> coloration de la molécule d"intérêt
2 colorations = PAS (résidus glucidiques = rose) / Feulgen-Rossenbeck (ADN = bleu)
Résultats
Mo de la molécules d'intérêt (lipides, protéines, sucres, acides nucléiques)
Histo-Enzymologie
Principe
Présence de l'enzyme recherchée = substrat
Action de l'enzyme = réaction colorée visible au M
Ex = Peroxydase
Résultat
Localisation d'une enzyme en MO
DAB = MEB
Immuno-Histologie
Principe recherche d'un antigène
Révélation directe = réaction antigène-anticorps
fluorochrome = MOa
une enzyme = Mo produit coloré
billes d'or colloïdales (1-20nm) = MET
Révélation indirecte
anticorps primaire + anticorps secondaires = amplifie le signal
Résultat
Détection au MO ou MET de protéines ou glycoprotéines (pas pour lipide ni glucide)
tissus congelés ou fixation + inclusion par paraffine/époxy
Hybridation in situ
Principe
Hybridation de la séquence recherchée avec une sonde complémentaire d'acide nucléique simple brin marquée (ADN/ADN ; ARN/ADN; ADN/ARN
oligonucléotides = petite séquence Ac nucleique
2 types de sondes
sonde froide = marquage biotine-avidine, digoxigénine, flurochrome
sonde chaude = marquage radioactif, isotopes, émulsion photographique
Ex = ARNm viraux
Résultat
Localisation d'une séquence nucléotidique
Info sur expression des gènes
Autoradiographie
Principe
Incubation = tissu + mol radioactive --> suivre protéine (marquage Ac Aminé) ou Ac nucléique (marquage nucléotide)
Rinçage avec du milieu froid
Emulsion photographique avec grains d'argent
Révélation sans lumière = rayonnement β-
Observation des grains d'agents reduits
Ex = récepteurs aux neuromédiateurs
Résultat
détection mol radioactive (protéine / ADN)
observation MO ou MET
Radioactivité = suivi du devenir d'une molécule dans le temps (ADN protéines)
Culture cellulaire
Extraction de purification et détermination de séquence protéique et acide nucléique (PCR, RT-PCR)
Outils informatique