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Mapa de Secuencia del Procedimiento para la Obtención de ADN Recombinante …
Mapa de Secuencia del Procedimiento para la Obtención de ADN Recombinante
1. Obtención del ADN
Obtener muestras biológicas que contengan ADN de interés, por ejemplo, tejido o sangre.
2. Aislamiento del ADN
Romper las células de la muestra para liberar el ADN utilizando métodos de lisis celular.
Eliminar proteínas y otros contaminantes mediante el uso de detergentes, enzimas proteolíticas (como la proteinasa K) y técnicas de centrifugación o precipitación con etanol.
3.Amplificación del ADN
Utilizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar regiones específicas del ADN, generando múltiples copias de la secuencia de interés. Esto aumenta la cantidad de ADN disponible para la siguiente fase.
4. Detección del ADN
Verificar que el ADN aislado y amplificado sea el correcto, mediante técnicas como electroforesis en gel o análisis por secuenciación.
Confirmar el tamaño y la integridad del ADN.
5. Selección del vector
Elegir un vector adecuado (plásmido, bacteriófago, cosmid, etc.) que permitirá la introducción del ADN recombinante en la célula huésped.
El vector debe tener características esenciales como un origen de replicación, marcadores de selección y sitios de clonación múltiple.
6. Manipulación del ADN
Cortar tanto el ADN de interés como el ADN del vector utilizando enzimas de restricción que generen extremos compatibles.
Asegurar que los extremos sean compatibles para la unión posterior.
7. Unión del material genético humano al vector
Ligar el fragmento de ADN de interés al vector utilizando la enzima ADN ligasa.
Esta reacción genera el ADN recombinante, uniendo covalentemente el fragmento de ADN al vector.
8 Generación de moléculas clonadas
Introducir el vector recombinante en una célula huésped (generalmente bacterias) mediante transformación o transfección.
Permitir que la célula huésped se replique, produciendo múltiples copias del ADN recombinante a medida que se replica el vector.
Seleccionar las células que contienen el ADN recombinante usando un marcador de selección presente en el vector, como resistencia a antibióticos.