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capitolo 11 micro - Coggle Diagram
capitolo 11 micro
le sonde molecolari devono possedere un sistema rivelatore, la scelta del marcatore dipende dal tipo di risoluzione desiderata, dalle caratteristiche di sensibilità, dalla stabilità nel tempo e dai rischi connessi alla sua manipolazione.
le sonde possono infatti essere calde o fredde (radioattive o no) le sonde calde si ottengono grazie alla marcatura con isotopi radioattivi, queste sonde sono molto sensibili e in grado di ibridare con quantità di DNA equivalenti a picogrammi.
la rivelazione delle sonde calde prevede l'uso di lastre autoradiografiche, che sono impresse dalle radiazioni emesse dagli isotopi.
le sonde fredde sono più stabili e meno problematiche da usare, si ottengono marcando i nucleotidi con:
biotina, una vitamina che si lega alle basi azotate
digossigenina, uno steroide estratto dalla digitalis purpurea che si lega ai nucleotidi pirimidinici
fluorocromi, come la fluoresceina
questo ibrido ottenuto viene rilevato con un microscopio a fluorescenza; se si usa la biotina o la digossigenina, la rivelazione avviene per via indiretta mediante tecniche immunoenzimatiche.
variando le condizioni di temperatura, ibridazione e forza ionica, si possono unire anche filamenti non perfettamente complementari.
tecniche di ibridazione: il ricorso alle sonde molecolari avviene in 3 diversi ambiti di applicazione, per cui spesso si distingue tra ibridazione su filtro e IN SITU
su filtro avviene fra la sonda in soluzione e un acido nucleico immobilizzato su filtro di nylon o membrana di nitrocellulosa, lo schema prevede:
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il fissaggio dell'acido nucleico sul supporto mediante trattamento al calore o esposizione a raggi UV
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localizzare un gene o un qualsiasi frammento di DNA o RNA è come cercare un ago in un pagliaio. ci può però aiutare una particolare e peculiare caratteristica
ovvero l'univoca complementarietà delle singole basi azotate, questo permette alle sequenze spaiate di avere una naturale tendenza ad accoppiarsi alle sequenze complementari.
le sonde molecolari vengono costruite seguendo questo principio, e sono in grado di localizzare le sequenze complementari (gene target)
per identificare la sequenza polinucleotidica giusta si ricorre a sonde molecolari a DNA o RNA dette PROBES. quest'ultime sono frammenti specifici di DNA o RNA marcati radioattivamente o con fluorocromi
questi specifici frammenti hanno la capacità di ibridare, cioè riconoscere e legarsi solo ai tratti di DNA bersaglio. questa marcatura per decenni è stata effettuata con nucleotidi coniugati con isotopi radioattivi del fosforo e dello zolfo.
l'ibridazione sfrutta la spontanea tendenza di un filamento polinucleotidico denaturato ad associarsi al filamento mancante. affinché si possa formare l'ibridazione, sia la sonda che l'acido nucleico bersaglio devono essere nella forma di singoli filamenti.
quindi devono essere inizialmente denaturati e miscelati affinché possa avvenire l'ibridazione. le sonde possono essere lunghe 50 basi fino ad arrivare a alcune migliaia seconda delle diverse applicazioni.
le sequenze devono essere estremamente precise, sono sintetizzate mediante:
l'uso della trascrittasi inversa, che permette la sintesi di cDNA
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la sintesi chimica, partendo da nucleotidi trifosfati modificati.