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TEST MOLECOLARE COVID-19 - Coggle Diagram
TEST MOLECOLARE COVID-19
FASE 2
DOVENDO PROCESSARE MOLTI CAMPIONI, SI PUÒ UTILIZZARE UN ROBOT INSERITO IN UN SISTEMA CHIUSO CHE AGGIUNGE IN MODO AUTOMATICO TUTTE LE SOLUZIONI NECESSARIE PER PURIFICARE L’RNA VIRALE.
SE LE PARTICELLE DI SILICE SONO FISSATE A MICROSFERE MAGNETICHE, SI POSSONO RACCOGLIERE SUL FONDO DELLA PROVETTA CON UN MAGNETE.
IL BASTONCINO CON IL TAMPONE VIENE INFINE RIMOSSO DAL TUBO,
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LE PROTEINE E LE ALTRE BIOMOLECOLE COME I LIPIDI DI MEMBRANA,VICEVERSA, NON SONO TRATTENUTE DALLA COLONNA E VENGONO ELIMINATE DURANTE I LAVAGGI (HANNO UN’AFFINITÀ MOLTO BASSA PER LA SILICE).
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I REAGENTI NECESSARI PER ESTRARRE E PURIFICARE L’RNA VIRALE SONO FORNITI DA KIT COMMERCIALI, «APPROVATI»DALL’ORGANIZZAZIONE MONDIALE DELLA SANITÀ (OMS).
IL LISATO OTTENUTO DAI VIRIONI È CARICATO SU COLONNE DI AFFINITÀ (TUBI GIALLI); LE PARTICELLE DI SILICE PRESENTI NELLA COLONNA LEGANO CON FORZA L’RNA.
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LE MOLECOLE DI RNA SONO TRATTENUTE DALLA COLONNA PERCHÉ LE PARTICELLE DI SILICE LEGANO CON FORZA GLI ACIDI NUCLEICI.
NELLA SOLUZIONE DI LISI È PRESENTE ANCHE UNA SOSTANZA CHIMICA (GUANIDINIO ISOTIOCIANATO) CHE RINFORZA QUESTO LEGAME.
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FASE 3
I DIVERSI PROTOCOLLI SPERIMENTALI HANNO UNA LUNGHEZZA VARIABILE DELLA FASE DI AMPLIFICAZIONE E RILEVAMENTO DELLA FLUORESCENZA.
INOLTRE, LA PCR PUÒ SEGUIRE LA SINTESI DEL CDNA OPPURE AVVENIRE INSIEME AD ESSA (ONE-STEP RT-PCR).
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DIAGNOSI MOLECOLARE PER COVID-19:IL TEST MOLECOLARE PER CONFERMARE L’INFEZIONE ACUTA DA SARS-COV-2 È BASATO SULLA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR = POLYMERASE CHAIN REACTION)
DURANTE LA SINTESI DEL DNA L'ENZIMA TAQ POLIMERASI “MANGIA” LO SCHELETRO DELLA SONDA, LIBERANDO IL REPORTER CHE INIZIA COSÌ A EMETTERE FLUORESCENZA.
+DNA È PRODOTTO DURANTE LA REAZIONE DI PCR, + AUMENTA IL SEGNALE DI FLUORESCENZA.
PRIMER DI PCR: I REAGENTI FONDAMENTALI PER ESEGUIRE IL TEST RRT-PCR, OVVERO I PRIMER OLIGONUCLEOTIDICI,
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A TALE SCOPO SONO DISPONIBILI DIVERSI KIT COMMERCIALI CHE FORNISCONO L’ENZIMA TRASCRITTASI INVERSA,
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STRUMENTAZIONE: TERMOCICLATORE: STRUMENTO IN GRADO DI VARIARE LA TEMPERATURA DI REAZIONE IN MODO CICLICO SEGUENDO I PARAMETRI SPERIMENTALI IMPOSTATI DALL’OPERATORE.
UNITÀ OTTICA: LO STRUMENTO POSSIEDE ANCHE UNA FONTE DI LUCE LASER PER ECCITARE LA SONDA FLUORESCENTE E UNA CAMERA CCD CHE REGISTRA I DATI.
I DATI SONO INVIATI A UN COMPUTER,COLLEGATO AL TERMOCICLATORE: UN SOFTWARE LI ANALIZZA E LI MOSTRA NEL MONITOR.
LE SONDE TAQMAN (TAQ POLIMERASI + PACMAN = TAQMAN) TROVANO UN LARGO IMPIEGO NELLA DIAGNOSTICA DI LABORATORIO, PERCHÉ AUMENTANO LA SPECIFICITÀ DELLA REAZIONE DI PCR.
LA SONDA, AGGIUNTA INSIEME AI PRIMER DI PCR, POSSIEDE UN FLUORO FORO “REPORTER” ALL’ESTREMITÀ 5’ (6-FAM: 6-CARBOSSIFLUORESCEINA),
MENTRE NEL LATO OPPOSTO È PRESENTE UN “QUENCHER” (TAMRA: 6-CARBOSSI-TETRAMETIL-RODAMINA) CHE NE SMORZA IL SEGNALE.
LE MOLECOLE DI RNA VIRALE DEVONO ESSERE COPIATE IN DNA COMPLEMENTARE (CDNA) PER RENDERE EFFICIENTE LA REAZIONE A CATENA DELLA DNA POLIMERASI.
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FASE 1
X CONTENERE IL POTENZIALE CONTAGIO, LA PROCEDURA È SVOLTA DA PERSONE ADDESTRATE CHE INDOSSANO I NECESSARI DISPOSITIVI DI PROTEZIONE INDIVIDUALE (DPI):
• GUANTI MONOUSO• CAMICE MONOUSO• CUFFIA PER CAPELLI MONOUSO.• MASCHERINA MONOUSOFFP2/FFP3• PROTEZIONE X GLI OCCHI (OCCHIALI O SCHERMO FACCIALE DI PROTEZIONE).
I CAMPIONI PRELEVATI SI CONSERVANO INTATTI IN FRIGO (+4°C) X CIRCA 48 ORE O X TEMPI + LUNGHI IN UN CONGELATORE (–80°C),
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SUBITO DOPO IL PRELIEVO, LO SPAZZOLINO È IMMERSO IN UN LIQUIDO SPECIALE, CHE PROTEGGE LE MOLECOLE BIOLOGICHE E NE EVITA IL DEGRADO.
LA SUPERFICIE ASSORBENTE È COMPOSTA DA TANTI PICCOLI FILI DI COTONE-NYLON CHE AGISCONO COME UN SOFFICE «SPAZZOLINO».
IL BASTONCINO È SPEZZATO A METÀ, POI IL CONTENITORE VIENE CHIUSO CON IL TAPPO.
SE IL PRELIEVO E IL TRASPORTO SONO SVOLTI CORRETTAMENTE, I VIRUS ARRIVANO ANCORA INTEGRI AI LABORATORI DI ANALISI.
RACCOLTA DEL CAMPIONE TAMPONE NASO OROFARINGEO: SI ESEGUE CON UN ATTREZZO SOTTILE CHE ASSOMIGLIA A UN GRANDE COTTON FIOC.
FASE 4
NEI PRIMI GIORNI DEL CICLO VIRALE UN SOGGETTO PUÒ RISULTARE NEGATIVO AL TEST, PUR ESSENDO INFETTO.
AVER AMPLIFICATO TRACCE DI RNA SARS-COV-2 NON SIGNIFICA NECESSARIAMENTE CHE IL PAZIENTE SIA CONTAGIOSO, PERCHÉ IL TEST NON DISTINGUE TRA «VIRUS VIVI» E «VIRUS MORTI».
A DIFFERENZA DELLA PCR TRADIZIONALE, L’ANALISI IN TEMPO REALE È UN SAGGIO QUANTITATIVO:
IL PUNTO IN CUI LA CURVA DI FLUORESCENZA INCONTRA LA LINEA DEL VALORE SOGLIA DEFINISCE IL CICLO SOGLIA (CT; THRESHOLD CYCLE).
BASSI VALORI DI CT SONO ASSOCIATI AI CAMPIONI CON MOLTE MOLECOLE DI DNA STAMPO; VICEVERSA, I CAMPIONI CON POCHE MOLECOLE DI DNA STAMPO AVRANNO ALTI VALORI DI CT.
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ANALISI DEI RISULTATI:
L’AMPLIFICAZIONE DEI PRODOTTI DI PCR AVVIENE IN TEMPO REALE MENTRE IL TERMOCICLATORE MISURA L'INTENSITÀ DEL SEGNALE FLUORESCENTE EMESSO DALLE SONDE MOLECOLARI.