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PCR - Coggle Diagram
PCR
RT-PCR
IL PRODOTTO DELLA RETROTRASCRIZIONE DELL'RNA, ANCHE DETTA REAZIONE FIRST-STRAND, PUÒ ESSERE AMPLIFICATO MEDIANTE PCR CLASSICA,
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I PRIMER + COMUNEMENTE USATI SONO GLI OLIGO(DT), OVVERO SEQUENZE OLIGONUCLEOTIDICHE DI TIMIDINA PENSATE PER APPAIARSI ALLA CODA POLIADENILATA DEGLI RNA.
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MEDIANTE L'IMPIEGO DELLA RT-PCR È POSSIBILE CONVERTIRE IN DNA UN INTERO TRASCRITTOMA (INSIEME DI TUTTO IL TRASCRITTO DI UNA CELLULA)
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QUESTA TECNICA CONSISTE NELLA SINTESI DI UNA MOLECOLA DI DNA A DOPPIO FILAMENTO A PARTIRE DA UNO STAMPO DI RNA.
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X TALE MOTIVO, LA RT-PCR È UNA TECNICA CHE VIENE SFRUTTATA IN LABORATORIO PER STUDIARE L'ESPRESSIONE GENICA,
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LA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI INVERSA, NOTA ANCHE CON LA SIGLA RT-PCR (DA REVERSE TRANSCRIPTASE-POLYMERASE CHAIN REACTION),
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SINTETIZZATO IL 1° FILAMENTO, PRIMA DI PROCEDERE CON L'AMPLIFICAZIONE DEL CDNA,
VIENE AGGIUNTO ALLA REAZIONE L'ENZIMA RNASI (SOLITAMENTE DERIVATA DAL BATTERIO ESCHERICHIA COLI) CHE DEGRADA IL FILAMENTO DI RNA ORIGINALE CHE È STATO USATO COME STAMPO DALLA TRASCRITTASI INVERSA.
SE INVECE SI VUOLE AMPLIFICARE UN CAMPIONE DI RNA PRIVO DELLA CODA DI POLIADENOSINA I PRIMER + INDICATI SONO:
GLI "ESAMERI CASUALI" (IN INGLESE "RANDOM HEXAMERS") O I "NONAMERI CASUALI" (IN INGLESE "RANDOM NONAMERS"):
SEQUENZE CASUALI DI 6 O 9 BASI CHE ESSENDO APPUNTO CASUALI POSSONO POTENZIALMENTE FUNGERE DA PRIMER PER QUALSIASI SEQUENZA STAMPO DI RNA.
IL PRIMER FORNISCE UN 3'-OH LIBERO UTILIZZABILE DALLA TRASCRITTASI INVERSA PER GENERARE UN FILAMENTO DI DNA COMPLEMENTARE AL TRASCRITTO.
QUESTA FASE VIENE DETTA DI ALLUNGAMENTO E IL SUO ANDAMENTO È STRETTAMENTE DIPENDENTE DALLA NATURA DELL'ENZIMA.
QUANDO LA RETROTRASCRIZIONE È COMPLETA, IL CDNA GENERATO VIENE AMPLIFICATO TRAMITE UNA METODICA
DI PCR STANDARD
SUCCESSIVAMENTE PORTANDO LA TEMPERATURA A 95 °C,
LA NUOVA MOLECOLA DI DNA SI DENATURA E I 2 FILAMENTI COSÌ SEPARATI SONO PRONTI X UN NUOVO APPAIAMENTO DEI PRIMER E X LA SINTESI DA PARTE DELLA POLIMERASI,
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SE NON SI DISPONE DELLA SEQUENZA O SE INTERESSA L'AMPLIFICAZIONE DI TUTTO IL DNA,
IL 2° PRIMER SARÀ ASPECIFICO IN MODO TALE CHE SI APPAI CON L'ESTREMITÀ DEL 1° FILAMENTO DI DNA E DI TUTTI I CDNA NEOSINTETIZZATI.
DAPPRIMA VIENE SINTETIZZATA UNA MOLECOLA DI DNA A DOPPIO FILAMENTO A PARTIRE DALLA MOLECOLA DI CDNA,
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DOPO CIRCA 30 CICLI, SARANNO STATI PRODOTTI MILIONI DI COPIE DELLA SEQUENZA DI INTERESSE.
UNA DNA POLIMERASI DNA-DIPENDENTE TERMOSTABILE,
UN ENZIMA CON ATTIVITÀ 5'→3' POLIMERASICA VIENE AGGIUNTA ALLO STAMPO DI CDNA E IN PRESENZA DI UNA COPPIA DI PRIMER SPECIFICI PER LA SEQUENZA DEL GENE CHE SI DESIDERA AMPLIFICARE,
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