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WESTERN BLOTTING, Os valores obtidos através do espectrofotometro são…
WESTERN BLOTTING
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Transferência
Capilaridade do gel permite que o tampão entre nos poros e remova as proteínas para a membrana, mantendo-as separadas
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A membrana pode ser do tipo de nitrocelulose (baixo custo) ou PVDF (maior sensibilidade, capacidade de ligação com as proteínas e tempo de retenção)
Contato direto entre o gel e uma membrana, sob aplicação de um campo elétrico, num ambiente imerso em tampão básico
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Revelação
Colorimétrica
Conversão do corante solúvel em insolúvel, colorindo a membrana e gerando as bandas
Após a lavagem para a remoção do corante, a expressão proteíca é analisada por densitometria
Incubação da membrana com substrato que reaja com a enzima reveladora, como a peroxidase, que está conjugada ao anticorpo secundário
Fuorescente
Quando excitada no comprimento de onda apropriado, esta sonda emite a fluorescência que é captada por um fotossensor, como uma câmera CCD
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Não necessita de subtratos enzimáticos, pois o Ac secundário está acoplado a uma sonda fluorescente
Quimioluminescência: incubação da membrana com substrato que emite luz após a reação com a enzima reveladora
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Princípio
Sequências de aminoácidos variam de acordo com a proteína: Identificação e quantificação de uma proteína específica em meio a milhares de outras
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Extração de proteínas
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Compostos que promovam a lise celular: retirar as proteínas de dentro da célula para conseguir fazer a identificação
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Eletroforese
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O tamanho dos poros do gel pode ser ajustado variando a [ ] da acrilamida adicionada para retardar a migração da sua proteína de interesse. Quanto mais poliacrilamida mais as proteínas vão ser retidas
Aquecimento das amostras (95ºC)- para que as proteínas mudem a conformação e deixem os epítopos disponíveis para a ligação dos Acs
Incubação com Anticorpos
Anticorpo primário: reagir com um epítopo da proteína, formando um complexo anticorpo-antígeno. Específico para a proteína de interesse (overnight)
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Lavagem com tampão de lavagem para retirar todo o anticorpo que não está especificamente ligado à proteína de interesse
Bloqueio com leite: cobre as regiões da membrana que não possuem as proteínas submetidas à eletroforese, evitando ligações inespecíficas do anticorpo
Anticorpo secundário: anti-IgG, ou seja, é um anticorpo que reconhece um anticorpo. Específico para a espécie animal na qual foi desenvolvido o anticorpo primário
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Os valores obtidos através do espectrofotometro são utilizados na construção de uma curva de padronização, depois são aplicadas várias equações e é obtido um coeficiente de correlação linear
Finalidade de fazer a análise das proteínas para que elas estejam detro da curva de albumina, ou seja, a [ ] das proteínas tem que estar entre 0,5-0,125 mg/mL e também não pode haver uma discrepância muito grande entre elas
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