Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
MTFP1 控制线粒体融合,调节内膜质量控制并维持 mtDNA 水平 - Coggle Diagram
MTFP1 控制线粒体融合,调节内膜质量控制并维持 mtDNA 水平
摘要
线粒体动力学在细胞命运决定以及控制 mtDNA 水平和分布中发挥着关键作用
将线粒体膜重塑和质量控制与线粒体DNA拷贝数(CN)调节联系起来的分子机制仍然难以捉摸
这篇文章证明了线粒体内膜 (IMM) 蛋白线粒体裂变过程 1 (MTFP1) 负向调节 IMM 融合
通过调节 MTFP1 水平来操纵线粒体融合会导致 mtDNA CN 调节
机制
MTFP1 抑制线粒体融合,以将受损的 IMM 子域与网络的其余部分隔离并排除
外周裂变确保它们分离成富含 MTFP1 的小线粒体 (SMEM),这些线粒体以自噬依赖性方式进行降解
依赖于 MTFP1 的 IMM 质量控制对于基础类核回收至关重要,因此对于维持细胞内足够的 mtDNA 水平至关重要
引言
线粒体
膜结合细胞器
具有线粒体外膜(OMM)和线粒体内膜(IMM)
IMM 伸入线粒体基质,其中包含包装成蛋白质-DNA 复合物(称为类核)的线粒体基因组
线粒体 DNA (mtDNA) 编码呼吸链不同复合物的 13 个核心亚基,对于维持细胞代谢和生命至关重要
只需要两个拷贝的核 DNA (nDNA) 即可维持细胞稳态,而 mtDNA 分子的数量可以从数百到数千个拷贝不等,具体取决于细胞类型和细胞要求
mtDNA 水平(拷贝数 [CN]) 在细胞水平上受到严格调控,但人们对潜在的控制机制知之甚少
与 nDNA 不同,mtDNA 独立于细胞周期而不断更新(“松弛复制”),尽管 mtDNA 复制机制已得到很好的描述,但 mtDNA 如何降解仍不清楚。
线粒体形成一个动态且相互连接的网络,经历裂变和融合
碎片化和互连线粒体之间的平衡形状转变不仅需要确保线粒体功能,而且还需要通过使网络适应细胞的代谢状态来响应细胞需求
需要对线粒体动力学进行微调以维持 mtDNA 水平,并且对于线粒体质量控制也至关重要
线粒体分裂将受损的细胞器区域分离成小线粒体,以促进其自噬降解
取决于来源和受损的严重程度,分离的线粒体可能会与更健康的线粒体重新融合,以减轻功能障碍
如果损伤阈值是不可逆的,则需要将这些小线粒体从网络中排除才能降解
在通过外周裂变分离之前和之后,改变的 IMM 子结构域如何被分离并从健康的融合网络中排除仍然知之甚少
线粒体裂变过程 1 (MTFP1) 蛋白
是一种完整的 IMM 蛋白
之前被认为是作用于动力相关蛋白 1 (DRP1) 上游的促裂变因子,
将裂变过程与驱动细胞命运决定的多种关键途径耦合起来 ,例如哺乳动物雷帕霉素靶点复合物 1 (mTORC1) 激活、细胞死亡、癌症进展和线粒体生物能学
然而,MTFP1 如何机械调节线粒体形态仍然难不清楚
这篇文章证明MTFP1 协调 IMM 融合抑制与 OMM 分裂机制,以促进外周线粒体分裂
MTFP1 介导的融合活性丧失确保了改变的 IMM 子域的分离和自噬降解,这是细胞用来降解线粒体核仁并维持生理 mtDNA 水平的质量控制过程
MTFP1 缺失促进线粒体融合和过度分支
MTFP1 如何调节膜重塑
DRP1 的缺失会导致出现少量但细长的线粒体,而 MTFP1 沉默则诱导了广泛的相互连接的线粒体网络,与线粒体过度分支相关
与对照细胞相比,通过 CRISPR/Cas9 技术在 U2OS 细胞中生成的两个 MTFP1 敲除 (KO) 克隆(KO1 和 KO2)也表现出超支化线粒体
透射电子显微镜 (TEM) 证实了缺乏 MTFP1 的 U2OS 细胞的细长且相互连接的线粒体形态
MTFP1-KO U2OS 细胞中 MTFP1 的稳定重新表达将线粒体形态恢复到与对照细胞中观察到的相似水平,证明了表型的特异性
线粒体裂变
使用超分辨率 (SR) 晶格结构照明显微镜 (SIM)活细胞成像测量野生型 (WT) 和 MTFP1-KO 细胞的线粒体裂变速率
数据表明,尽管 MTFP1 并不是驱动线粒体分裂所必需的,但它可能是外周线粒体亚结构域分裂所必需的
MTFP1-KO 细胞显示小圆形线粒体数量减少
MTFP1 的过表达与小圆形线粒体的形成增加相关,表明 MTFP1 促进外周裂变
将 MTFP1 沉默细胞的线粒体表型与中区涉及的 DRP1 接头缺失情况下观察到的线粒体表型进行了比较 ,包括外周裂变、线粒体裂变因子 (MFF) 和线粒体裂变蛋白 1 (FIS1)
虽然缺乏 MFF 的细胞具有与 DRP1-KO 细胞中观察到的类似的延长表型,但 FIS1 沉默的细胞仅表现出适度的延长表型。
与 MFF 和 FIS1 缺陷细胞相比,MTFP1 沉默细胞中线粒体互连的数量显着更高,这表明中区或外周线粒体区域的机械分裂缺陷不能解释 MTFP1 丢失引发的超分支表型
在用线粒体应激源处理后,或在促进 DRP1 募集至线粒体时(由 MFF 或线粒体锚定蛋白连接酶 [MAPL] 过表达触发),MTFP1-KO 线粒体片段与 WT 细胞类似 ,从而表明 MTFP1 不需要执行线粒体分裂
线粒体融合过程的动态
两种不同的模式
完全融合,导致形成单个稳定的线粒体
瞬时融合(接吻和奔跑)
MTFP1-KO 细胞中的线粒体融合更加稳定,事件持续时间增加表明,导致完全融合率提高,瞬时线粒体融合率降低
随着时间的推移,线粒体基质靶向光激活 GFP 探针(鸟氨酸氨甲酰转移酶;[OCT]PA-GFP)的扩散增加,证实了 MTFP1-KO 线粒体融合能力的增加
促融合因子线粒体融合蛋白 2 (MFN2) 和视神经萎缩 1 (OPA1) 的沉默可挽救在 MTFP1-KO 和沉默细胞中观察到的过度线粒体分支,但在 DRP1-KO 细胞中则不然
DRP1-KO 细胞中 MTFP1 的沉默将延长的线粒体转移到一个更加互连的网络,表明 MTFP1 依赖性超分支的发挥独立于 DRP1
放线菌酮 (CHX)
可以化学诱导线粒体分支,从而导致应激诱导的线粒体过度融合
CHX 处理在 DRP1-KO 细胞中诱导线粒体超分支,但在过表达 MTFP1 的 DRP1-KO 细胞中则不然,,证实了 MTFP1 在抑制线粒体融合中的积极作用
结果表明,MTFP1 缺失所诱导的线粒体分支和相互连接与线粒体融合能力的增强有关,而不是线粒体分裂能力的下降。
使得 MTFP1 成为一种对抗线粒体融合的 IMM 蛋白
MTFP1 降低线粒体外周 IMM 融合能力
MTFP1 如何同时调节线粒体融合和外周裂变
MTFP1-KO 细胞表现出较低水平的 FIS1 和较高水平的短 OPA1 (S-OPA1) 亚型
FIS1 水平在 MTFP1 沉默的细胞中保持不变(图 1K),表明 FIS1 下调需要永久删除 MTFP1
尽管 MTFP1-KO 细胞中总 DRP1 水平上调,但线粒体 DRP1 募集却减少了
MTFP1 如何控制 IMM 重塑
急性MTFP1过表达导致线粒体断裂,但不影响不同裂变和融合因子的蛋白质水平,除了长(L)-OPA1水平降低
MFN2与MTFP1的共表达消除了MTFP1驱动的线粒体断裂,证实了MFN2促进线粒体融合以及与MTFP1过表达具有拮抗作用
MTFP1 在线粒体中分布不均匀。 虽然 MTFP1 在小片段线粒体内均匀分布,但MTFP1 向线粒体外围特异性重新分布,描绘 IMM 子域,及其在线粒体中心区域的积累,勾勒出“隔膜状”结构
线粒体“隔膜”被描述为 IMM 融合中间体,当 IMM 融合受到抑制时会积累
MTFP1 过表达导致线粒体外周隔膜和 IMM 子室的形成
DRP1-KO 细胞中 MTFP1 的过表达还诱导了外周 IMM 子室和隔膜的生成,但不驱动线粒体断裂
表明,尽管MTFP1触发的IMM融合抑制和重塑独立于DRP1发生,但随后的线粒体外周分裂仍然需要OMM裂变机制
MTFP1 在隔膜样结构和线粒体-线粒体接触位点的持续定位,其中两个相对的线粒体保持紧密并列,但没有发生完全融合
虽然一些富含 MTFP1 的子域经历外周裂变,导致小线粒体的形成,但大多数 MTFP1 子域在线粒体外周保持稳定
富含 MTFP1 的子域和富含 MTFP1 的小线粒体均未发现发生线粒体融合
表明 MTFP1 本身并不驱动不对称膜裂变,而是隔离并保护某些 IMM 子域免于与网络的其余部分融合,从而将这些区域标记为外围分裂。
MTFP1 如何抑制线粒体融合
发现 MFN1、MFN2、OPA1 和一些线粒体接触位点和嵴组织系统(MICOS)成分与 MTFP1 有潜在相互作用
尽管 MTFP1 可能与这些蛋白质密切接触,但它们的相互作用可能是间接或短暂的
MTFP1通过创建非融合脂质环境来抑制线粒体融合,从而影响OPA1寡聚化及其随后驱动IMM融合的能力
通过 MTFP1 增加绝对 mtDNA CN;抑制改善异质性模型中的形态和生化缺陷
异质性反映了单个细胞或个体内多种 mtDNA 单倍型(WT 和突变体)的共存
当突变体 mtDNA 的百分比超过一定水平(生化阈值)时,线粒体出现功能缺陷,导致线粒体疾病
分析了 MTFP1 丢失对异质性水平高或低的克隆中 mtDNA CN 的影响
MTFP1 抑制显着增加了 mtDNA CN,不仅在选定的高异质性和低异质性克隆中,而且在所有其他测试的克隆中
MTFP1沉默还挽救了在高异质性克隆中观察到的线粒体断裂表型,并将低异质性和高异质性细胞中的线粒体形态转变为分支表型
增加绝对 mtDNA 水平可以改善线粒体疾病模型的表型
通过 MTFP1 抑制增加 mtDNA CN 是否对 DH2.1 缺失细胞有益
MTFP1沉默不仅部分挽救了MTCO2和ATP8的水平(图S5J和S5K),而且还改善了在高异质性克隆中观察到的线粒体呼吸缺陷
总之,这些数据表明,通过增强 IMM 融合能力来增加绝对 mtDNA CN 对于携带异质致病性 mtDNA 突变的细胞可能是有益的。
MTFP1 调节 mtDNA CN
急性 MTFP1 过表达导致 mtDNA CN 水平降低
MTFP1 沉默或 KO(图 3B 和 3C)诱导 mtDNACN 增加,这在稳定的 MTFP1 重新表达后得以恢复(图 3D)
MTFP1-KO 细胞还对 OPA1 沉默引起的 mtDNA 耗竭具有部分抵抗力
总体而言,这些发现表明 MTFP1 驱动控制基础 mtDNA 含量的调节机制
MTFP1 促进 IMM 子结构域靶向自噬结构
MTFP1 过度表达导致出现小的功能障碍线粒体,其特征是膜电位降低和活性氧 (ROS) 水平增加
MTFP1-KO 细胞中线粒体溶酶体数量减少,表明 MTFP1 消除可能会减慢内部线粒体成分的回收
MTFP1 过表达导致线粒体与线粒体之间的 MTFP1(+) 亚区形成,这些亚区含有 mtDNA 分子
高 MTFP1 水平与 TOMM20 蛋白水平(图 S6H)和信号强度(图 4B)的降低相关
MTFP1(+)/TOMM20(--) 线粒体称为小 MTFP1 富集线粒体 (SMEM)
SMEM 与 LAMP1 标记的降解溶酶体结构共定位(图 4D 和 4G)
SMEM 与LC3B 和 p62 呈阳性的自噬体结构共定位
CQ 处理增加了自噬体中 SMEM 的存在(图 4H 和 4I),表明这些专门的 IMM 子室在溶酶体递送之前首先针对自噬体
DRP1-KO 细胞中 MTFP1 的过度表达未能触发 SMEM 运输至溶酶体(图 S6K 和 S6L),表明 IMM 融合活性丧失和 OMM 裂变机制之间的耦合机制是有效自噬降解所必需的。
检测到 MTFP1 和 LC3B-II 之间的相互作用,但未检测到与胞质 LC3B-I 之间的相互作用(图 4J),这种相互作用在不同的 MTFP1-LIR 突变体(mLIR)中被部分破坏,并在 MTFP1-三重 LIR 突变体中被消除 (mLIRx3)(图 4K),MTFP1mLIRx3 仍然能够诱导线粒体断裂
MTFP1mLIRx3 过表达细胞中,SMEM 运输到自噬体的数量和百分比均有所减少,但我们观察到这些结构中的一定比例仍然针对 LC3 阳性膜(图 4N-4P),这表明 SMEM 可以 至少部分被降解,独立于 MTFP1-LC3B相互 作用
MTFP1 促进核质周转
MTFP1 控制的 mtDNA CN 调控的分子机制
MTFP1 抑制导致非复制和复制核仁数量增加,而不影响复制 mtDNA/总 mtDNA 比率
表明,MTFP1 的丢失不会增加 mtDNA 复制能力,但可能导致 mtDNA 清除效率低下,从而导致核苷的积累
MTFP1-KO 细胞中含有 mtDNA 的核仁数量增加,而没有显着改变核仁大小
MTFP1 缺失导致 mtDNA 含有核质数量增加,核心核质成分 SSBP、TFAM 和 Twinkle 水平升高
还检测到 IMM 蛋白子集的水平增加,包括 PHB2 和线粒体呼吸链亚基
数据表明 MTFP1 可能参与含有 mtDNA 的选择性 IMM 子结构域的降解
为了阐明 MTFP1 是否不仅是基础 mtDNA 降解所必需的,而且也是处理受损核仁所必需的
用 DNA 嵌入剂溴化乙锭 (EB) 处理 WT 和 MTFP1-KO 细胞,据报道,EB 会干扰 mtDNA 结构 。 一致地,MTFP1-KO 细胞在基础条件下表现出 mtDNA 水平数量增加,并且对 EB 诱导的类核降解具有部分抵抗力,证实了 MTFP1 对 mtDNA 清除的贡献
富含 MTFP1 的线粒体将各种 IMM 货物递送至自噬体
在更受控的条件下 IMM 子域的自噬靶向
无法在基础条件下检测到 SMEM 的存在
SMEM 的形成是通过用 CQ 阻断自噬流来可视化的
自噬和溶酶体细胞器的 SMEM 交通是分离的(图 5D 和 5E),并且通常在 LAMP1(+)结构内观察到核周 SMEM 簇,这是成熟自溶酶体的典型位置(图 5F)
沉默 FIS1 而不是 MFF 显着减少了 SMEM 的形成,图 5G-5I),证实了 FIS1 介导的外周裂变对此机制的贡献
由 MTFP1 标记的自噬前线粒体中运输的货物
SMEM 中存在多种蛋白质,其中 PHB2 是最主要的货物
OPA1 几乎不存在于 SMEM 中
在分析后的 SMEM 中,mtDNA 和 TFAM 存在于 15% 和 20% 的范围内
dsRNA)53 也在 MTFP1-KO 细胞中积累
MTFP1依赖性去除改变的IMM子域调节mtDNA回收
MTFP1 如何选择需要回收的 mtDNA 分子库
WT 和 MTFP1-KO 细胞系之间同质或异质线粒体单核苷酸变异 (mtSNV) 的负担没有差异
也没有观察到 WT 组和 MTFP1-KO 组之间 9 个常见异质性 mtSNV 的变异等位基因频率(异质性水平)之间的差异
表明 MTFP1 驱动的 mtDNA 更新不能区分不同的 mtDNA 等位基因
使用稳定表达 Flag-MTFP1 的 MTFP1-KO 细胞系监测 mtDNA 损伤期间 MTFP1 的动态
MTFP1 在未处理的细胞中沿着 IMM 均匀定位,但在添加 EB 后,我们观察到该蛋白质向线粒体外周和小线粒体重新分布
观察到这些子域中 PHB2 富集,但 TIMM23 没有富集(图 6F),这表明并非所有 IMM 蛋白都重新分布到这些外围区域
mtDNA 改变会导致生理缺陷 IMM 子域的形成,该子域可作为去除与该区域相关的突变 mtDNA 分子的信号
EB 治疗引起的 mtDNA 损伤会损害线粒体超微结构,导致 形成弯曲的洋葱状嵴
因此,我们假设 MTFP1 可能识别 IMM 改变而不是 mtDNA 本身
SR SIM 揭示MTFP1 装饰 mtDNA 分子周围的 IMM,而不是积累在类核结构中
通过暂时抑制 ATP5A 或 MICOS 亚基 MIC60,59 来破坏嵴结构,增加了 SMEM 对自溶酶体结构的靶向性
通过添加羰基氰化物间氯苯腙 (CCCP) 或使用 MitoParaquat60 增加线粒体内 ROS 引起的膜电位损失不会导致 MTFP1 分布发生任何变化,也不会触发 MTFP1 的形成。
表明,尽管 SMEM 表现出线粒体功能障碍的标志(图 S6B 和 S6C),但 MTFP1 在结构 IMM 改变时被特异性激活,
三天的 ATP5A 或 MIC60 沉默不会引起 mtDNA 损失
表明,虽然 mtDNA 损伤会触发 IMM 改变和随后的 MTFP1 重新分布,但 IMM 结构缺陷不一定会引起 mtDNA 降解。
ATP5A 或 MIC60 抑制引起的嵴缺陷导致 WT 中线粒体自噬诱导,但在 MTFP1-KO U2OS 细胞中则不然(图 7A 和 7B)