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METODI MOLECOLARI DI STUDIO DEI SISTEMI BIOLOGICI - Coggle Diagram
METODI MOLECOLARI
DI STUDIO DEI SISTEMI BIOLOGICI
GENETICA E
GENOMICA
come studiare
la diversità microbica?
colture su piastra
evidenziare il loro DNA
Mutazioni
Inserzione
aggiunta di una serie di coppie di basi
spesso provocate dai salti
dei trasposoni
Delezione
perdita di una sequenza di DNA
Mutazione Puntiforme
coinvolge una singola coppia di basi
transizioni: purina sostituita con l'altra (o pirimidine)
trasversioni: purina sostituita da una pirimidina
tasso di mutazione:
misura del tempo
evolutivo trascorso
DNA è un ottimo
strumento per la tassonomia
i marcatori possono essere determinati in modo non ambiguo
Il DNA codificante per l'rRNA batterico è il miglior marcatore batterico
Manipolazione e Visualizzazione DNA
manipolazione
enzimi di restrizione
scoperti nei batteri
per proteggersi dalle infezioni virali
tagliano determinate sequenze di DNA
visualizzazione
elettroforesi su gel
prendo lagarosio
molto purificato
lo inserisco in
un tampone borato
applico campo magnetico
DNA va dal polo negativo
al polo positivo
i frammenti più grandi sono i più lenti
I frammenti lineari corrono meglio dei frammenti circolari
Mappe Fisiche
(contigs)
insieme di regioni contigue
di DNA cromosomico in cui la
distanza fra i marcatori è
espressa in kilobasi
scheletro in cui possono
essere localizzati polimorfismi
sequenza nucleotidica
primo passo nell'assemblare
l'intera sequenza del genoma
2 differenti strategie
per assemblarle
Allineamento di cloni isolati in modo random sulla base di un profilo di restrizione comune
Chromosome walking
PCR
per amplificare o copiare
frammenti specifici di DNA
può essere
eseguita in vitro
tecnologia
semplice
Sequenziamento
SANGER (1977)
più complessa della PCR
Reazione
enzima estende i primers
il DNA stampo guida l'incorporazione dei dNTPs
l'estensione della catena si blocca quando i ddNTPs vengono incorporati
La terminazione della catena
avviene casualmente su ogni base
Cosa Serve
DNA templato
2' deossinucleotidi
(dNTPs)
DNA polimerasi
2',3' dideossinucleotidi
(ddNTPs)
nucleotide modificato
Primer
2' deossinucleotide
radioattivo
procedimento
frammento DNA denaturato in singoli filamenti
la sintesi di ciascun nuovo filamento inizia all'estremità 3' e prosegue fino a che non viene inserito un ddNTP al posto desossinucleotide corrispondente. Si ottiene un insieme di filamenti marcati di varia lunghezza
separazione filamenti marcati mediante elettroforesi su gel. lettura dal leggero al pesante
sequenziamento automatico
il deossinucleotide radioattivo è sostituito con dideossinucleotidi fluorescenti
elettroforesi su gel in una sola colonna
e laser scanner che rileva la fluorescenza
Strategie di sequenziamento
dei genomi
intere sequenze cromosomiche generate riassemblando frammenti di 500-800 bp
2 strategie fondamentali
Hierarchical
(clone by clone)
fasi
1 Clonaggio genoma in unità di dimensioni di 50-200 kb
2 Organizzazione cloni genomici in una mappa fisica
e selezionare il Minimal Tiling Path
3 Sequenziamento cloni selezionati e loro assemblaggio a formare contigs
4 assemblaggio contigs e ricostruzione della sequenza cromosomica
una volta nota la sequenza mediante clonaggio è necessario identificare la posizione all'interno del cromosoma: chromosome walking
Shotgun
fasi
1 frammentazione genoma e costruzione librerie plasmidiche
2 sequenziamento entrambe estremità ciascun clone
3 allineamento e assemblaggio di tutte le sequenze ottenute per la produzione di contig mediante utilizzo di algoritmi
4 Assemblaggio contig in impalcature e mappatura sui cromosomi
possibile ibridare le due strategie
SEQUENZIAMENTO EST
via più diretta per identificare un gene
sequenziare frammento di cDNA partendo dall'mRNA
EST: espressed sequence tags
sequenza singola derivata da un set random di mRNA
libreria di cDNA originata partendo da un tessuto specifico
il DNA a doppio filamento viene clonato in un plasmide
utilizzando primers della sequenza plasmidica viene sequenziato l'inserto
DNA microarray
3 Ibridazione
cDNA denaturato e applicato sui microarray
in ogni spot si legano cDNA diversi
4 Lavaggio e Rilevazione
lavaggio per rimuovere cDNA non legato
scansione per rilevare fluorescenza emeesa dai coloranti marcati
2 preparazione del microarray
ogni spot del microarray rappresenta un gene specifico
5 Analisi dei dati
la fluorescenza rilevata su ogni spot corrisponde alla quantità di cDNA presente nel campione originale
utilizzo di software specifici
1 preparazione del campione
simile all'EST e marcatura con coloranti fluorescenti
CGH
applicazione DNA microarray
per rilevare amplificazioni o delezioni di segmenti di DNA che possono essere associati a malattie genetiche, anomalie congenite e tumori.
Next Gen sequencing
technologies
Pirosequenziamento
ad ogni base aggiunta si crea un picco di luce grazie a PPi->ATP (with APS) e
luciferina -> ossiluciferina (with ATP). più alto il picco più basi di quel tipo son state aggiunte in quel segmento
sistema 454
preparazione libreria
pcr in emulsione
pirosequenziamento
SOLiD
sequenziamento con ligasi
sonda con le prime due basi specifiche e altre 6 degenerate
si lega la sonda corrispondentemente alle prime due basi libere della sequenza di riferimento, si cleavano le ultime tre. si fa così per tutte le sonde
si shifta il primer di una base indietro e si ricomincia
si confermano le basi della sequenza 2 volte almeno
altissima qualità, costo esorbitante
ION Torrent
sensore di ioni
rileva passaggio di ioni
quando si legano nucleotidi
analisi forza di
questi segnali
Illumina
MiSeq
ideale per sequenziamento singoli geni o piccoli pannelli di geni
da 1 a 25mln di reads per corsa
lunghezza massima reads 2x300bp
output massimo 15 GB
NovaSeq
ideale per applicazioni che richiedono grandi quantità di dati, come il sequenziamento dell'intero genoma umano
fino a 40 mld di reads per corsa
lunghezza massima read 2x250bp
output massimo 6 TB
PacBIO
single molecule real time sequencing
per sequenze lunghissime (10k paia di basi)
sequenziamento ciclico
polimerasi attaccata al pozzetto,
luce di emissione amplificata dal pozzetto
sequenziamento metagenomico
WGS
genoma intero
per mappare genomi di nuovi organismi, terminare genomi di organismi noti e confrontare i genomi su più campioni
WES
sequenziamento regioni codificanti dei geni
Targeted NGS
sequenziamento rRNA 16S e ITS usato per identificare e confrontare rispettivamente batteri o funghi presenti all'interno di un dato campione
metodo consolidato per confrontare filogenesi e tassonomia dei campioni da microbiomi complessi o ambienti difficili da studiare
SISTEMI
BIOLOGICI
specie
biologica: gruppo di organismi interfertili
tipologica: classe di oggetti che condividono un set di tratti scelti
cladistica
ricostruisce la filogenia classificando gli organismi viventi in base a criteri evolutivi
organismi simili hanno un antenato comune
la rappresenta con un albero filogenetico
fondata da Will henning
uno dei criteri in queste analisi è
la massima parsimonia
si sceglie il cladogramma con minor numero di nodi
simbiosi
i microbi si sono coevoluti
con piante e vertebrati
normali funzioni di questi sistemi complessi dipendono dalla presenza di simbionti
mediata da fattori ambientali, nutrienti, dieta, terreno.
teoria ologenomica dell'evoluzione
basata su
4 generalizzazioni
1 tutte le piante e gli animali stabiliscono relazioni simbiontiche con i microrganismi
2 microorganismi simbionti sono trasmessi tra generazioni
3 l'associazione tra ospite e simbionti influisce sull'adattamento dell'olobionte dentro il suo ambiente
4 variazioni nell'ologenoma possono essere portato da cambiamenti sia nei genomi dell'ospite sia nei genomi del microbiota
In condizioni di stress ambientale, la comunità microbica simbiotica può cambiare rapidamente.
il microbioma umano
più microbi che cellule nel corpo umano
analizzato con tecnica shotgun
unico per ogni umano, ma simile tra le varie popolazioni per motivi evoluzionistici
(la dieta influenza il microbiota)
il microbioma deriva parte dalla madre parte si forma nei primi anni di vita