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丙氨酰-tRNA 合成酶 (AARS1) 是一种乳酸传感器和乳酰转移酶，可乳酸化修饰 p53 并促进肿瘤发生 - Coggle Diagram
丙氨酰-tRNA 合成酶 (AARS1) 是一种乳酸传感器和乳酰转移酶，可乳酸化修饰 p53 并促进肿瘤发生
摘要
赖氨酸乳化
是一种将细胞代谢与蛋白质功能联系起来的翻译后修饰
AARS1
作用机制
AARS1作为乳酸传感器发挥作用，介导肿瘤细胞中的整体赖氨酸酰化
AARS1 与乳酸结合并催化乳酸-AMP 的形成，然后将乳酸转移至裂解受体残基
大量 AARS1 靶标
包括 p53，其中 DNA 结合域中的赖氨酸 120 和赖氨酸 139 被乳酰化
与P53关系
p53 的 AARS1 乳酰化阻碍了其液-液相分离、DNA 结合和转录激活
携带野生型 p53 的癌症患者中，AARS1 表达和 p53 酰化与不良预后相关
b-丙氨酸破坏乳酸与 AARS1 的结合，减少 p53 酰化，并减轻动物模型中的肿瘤发生
引言
代谢异常是癌症的一个标志
即使在有氧的情况下，大多数癌细胞也会沉迷于有氧糖酵解。这种代谢改变，也称为“瓦伯格效应”，会启动微环境并导致糖酵解中间体升高 例如乳酸支持细胞增殖
乳酸参与调节各种生物过程，如免疫细胞分化、肿瘤免疫监视、纤维化、缺血性损伤，以及通过一种叫做乳酰化的表观遗传修饰来调节基因表达
乳酸可以共价修饰蛋白质， 但检测细胞内乳酸并将其转化为乳酰化的机制仍不清楚
肿瘤抑制因子 p53 介导多种功能
作为一种转录因子，它通过激活众多控制 DNA 修复、细胞周期进程和压力下生存的靶点来保护细胞免遭恶性转化
P53 活性在肿瘤发生过程中通常受到抑制，超过一半的人类癌症含有 p53 损害 p53 肿瘤抑制活性的突变
p53 活性还受到翻译后修饰的调节，例如磷酸化、乙酰化和泛素化
AARS1 鉴定为细胞内乳酸传感器，可直接与乳酸结合并催化整体赖氨酸乳酸化，包括 p53
通过 ATP 依赖性乳酸-AMP 的形成，AARS1 将乳酸转移到与赖氨酸残基共价结合，并介导全蛋白质组赖氨酸乳酰基的形成
大肠杆菌AlaRS (EcAlaRS)也催化真核蛋白质组和p53的乳酰化，这表明AARS1的乳酰转移酶活性是一个古老且保守的功能
AARS1 在其 DNA 结合域 (DBD) 中介导位点特异性 p53 乳酰化，从而阻止 p53 与含有 p53 响应元件 (p53RE-DNA) 的 DNA 结合，从而抑制 p53 液-液相分离 (LLPS) 和转录
提出β-丙氨酸防止 p53 乳酰化的方法，β-丙氨酸与乳酸竞争与 AARS1 的结合，从而增强癌症化疗
肿瘤源性乳酸是 p53 的天然抑制剂，可促进 p53 乳酰化
携带野生型 p53 的患者中，那些具有代表高血清乳酸水平的基因特征的患者的 p53 信号通路得分显着较低,表明乳酸在肿瘤中可能会抑制 p53 功能。
在乳腺癌模型中，肿瘤乳酸水平在肿瘤发展过程中增加，并与肿瘤负荷呈正相关，表明细胞内乳酸积累可能促进肿瘤进展
乳酸钠注射导致可触及肿瘤（20 mm3）更早形成，并且肿瘤体积显着增大
给予乳酸钠的小鼠肿瘤中，p53 活性显着受到抑制
即使在对辐射的反应中，注射乳酸钠的动物中 p53 靶基因的诱导和小鼠胸腺中的细胞凋亡也有所减少
乳酸脱氢酶 A (LDHA) 将丙酮酸转化为乳酸，高 LDHA 表达与乳腺癌患者的较差生存率相关
LDHA 消耗导致肿瘤形成延迟（图 1E）、肿瘤乳酸和肿瘤负荷降低（图 1F 和 S1I）以及 p53 活性增加
糖酵解抑制剂 2-脱氧-D-葡萄糖 (2-DG) 或 LDHA 抑制剂草酸盐阻断内源性乳酸的产生，可显着增加表达野生型 p53 (p53+/+) 的肿瘤细胞中 p53 靶基因的表达
在 p53+/+ 细胞中用乳酸处理可抑制由 Nutlin-3（一种 MDM2 抑制剂）诱导的内源性 p53 激活
总的来说，这些发现表明肿瘤来源的乳酸是 p53 的天然抑制剂
乳酸是否在体外直接拮抗 p53
使用无细胞系统基于荧光素酶片段互补分析 (LCA) 来测量 p53 活性，其中只有活性 p53 才能降低荧光素酶活性
乳酸盐或乳酸钠的孵育不会改变 p53 活性； 然而，细胞裂解液的添加导致 p53 活性降低，这与乳酰化水平增加相关
在用乳酸盐或乳酸钠预处理的细胞中，在外源引入和内源存在的 p53 水平上观察到 p53 乳酰化的诱导，并且与乳酰化形式混合的纯化 p53 蛋白显示出显着降低的活性
使用糖酵解、2-DG 和草酸盐调节剂抑制乳酸产生，降低细胞内乳酸水平，并抑制包括 p53 在内的内源蛋白的整体乳酰化
表明乳酸可以在细胞中被感知并转化为 p53 乳酰化，然后使 p53 失活
全基因组 CRISPR 筛选确定 AARS1 是肿瘤细胞中整体赖氨酸乳酰化的介体
为了鉴定负责 p53 乳酰化的蛋白质，进行了全基因组 CRISPR 筛选
稳定表达与绿色荧光蛋白 (GFP) 融合并用全基因组引导 RNA (gRNA) 文库转导的 p53 诱导报告基因的 HeLa 细胞用乳酸预处理，并用 Nutlin-3 刺激
对前 10% GFP 阳性细胞进行分选并进行深度测序，以鉴定富集的 gRNA
在此筛选中，丙氨酰-tRNA 合成酶 1 (AARS1) 被确定为最强的命中
人类 AARS1（ HsAlaRS）是氨酰基-tRNA 合成酶 (ARS) 家族的成员，在蛋白质翻译过程中催化丙氨酸与 tRNA (Ala) 的附着
AARS1 耗尽会升高 Nutlin-3 诱导的 p53 响应报告基因和 p53 靶基因，使其对乳酸诱导的抑制反应脱敏
AARS1 耗尽的肿瘤细胞的增殖、集落形成和异种移植肿瘤生长显着减少；未能介导乳酸钠所产生的促肿瘤作用
AARS1 耗尽对阻断蛋白质合成没有明显影响，从而排除了蛋白质合成减弱导致肿瘤生长改变的可能性
使用蛋白质组学方法对整体赖氨酸乳酰化组进行了分析（图 2C），并发现乳酸诱导的乳酰化蛋白质组受到 AARS1 敲低的抑制
暂时耗尽 AARS1 后，大约 80% 的乳酰赖氨酸 (Klac) 肽和蛋白质强度下降（图 2E），高达 10% 的肽和蛋白质强度下降超过 10 倍（图 2F）
AARS1 的过度表达强烈增强了整个赖氨酸乳酰组
在 HsAlaRS 过表达的细胞中，90% 的乳酰化肽和蛋白质的强度显着增加，其中接近 50% 的强度增强了 10 倍以上（图 2H 和 2I）
AARS1 在许多物种中都是保守的，包括大肠杆菌
细菌酶 EcAlaRS 的过度表达也增强了细胞中整个赖氨酸乳酰组
人类 HsAlaRS 和 EcAlaRS 之间的目标位点和蛋白质的比较揭示了大规模的重叠
在赖氨酸乳酰组中，高达 73% 的乳酰化肽因 HsAlaRS 或 EcAlaRS 的异位表达而增强
这些观察结果表明，AARS1 可能在催化赖氨酸乳酰化中发挥着古老的作用，这种作用在从原核生物到哺乳动物的多种物种中都是保守的。
丙氨酸作为底物结合 AARS1
β-丙氨酸在结构上类似于乳酸，广泛用于改善运动表现
用 β-丙氨酸预处理的细胞显示赖氨酸乳酰基急剧减少
与AARS1耗尽的细胞类似，在β-丙氨酸处理的细胞中，约90%的乳酰化肽和蛋白质的强度降低，其中10%降低了10倍以上
当比较受调节的乳酰化肽时，AARS1 的化学抑制反映了 siRNA 消耗 AARS1 的情况
这些结果表明 AARS1 也可能使用乳酸作为乳酰化的底物，因此 β-丙氨酸可以有效地拮抗这一过程
AARS1 是否’导细胞中的 p53 乳酰化
乳酸刺激增强了内源性 p53 的乳酰化
内源性 p53 的乳酰化程度因 HsAlaRS 或 EcAlaRS 的过表达而显着增加，而因 β-丙氨酸而降低
模拟乳酰化的疾病相关 K120 和 K139 变体表现出 LLPS 降低和抑制肿瘤生长的能力
p53-DBD 突变构成了一系列恶性肿瘤中常见的“热点”
在P53中与癌症相关的突变宿主包括 K120N、K120Q、K120E、K139N、K139T、K139Q ，K139E
Lys 突变为 Asn、Thr、Gln，特别是 Glu，减少了其正电荷，模拟了相应 Lys 残基的乳酰化（图 6B）
各种研究表明 p53-K120N 可能没有功能，这些乳酰化模拟变体可能有助于肿瘤发生41-43（图 6C 和 S11B）
纯化的 K120N/Q/E 和 K139 N/T/Q/E 突变体表现出与 p53RE-DNA 的结合亲和力降低。 K120E 和 K139E 观察到更明显的减少（图 6D 和 6E），表明 K-to-E 突变导致更强的电荷减少。
K120N/Q 和 K139 N/T/Q 部分丧失了刺激 p53 响应基因表达的能力，而 K120E 和 K139E 几乎完全丧失
这些变体的 LLPS 和移动性也受到损害
p53-WT（而非 K120E 和 K139E 变体）抑制细胞增殖、克隆形成和异种移植肿瘤生长
与癌症相关的 p53 变体还表现出与 p53RE-DNA 相互作用减少，从而防止 p53 LLPS 和激活
乳酰化和乙酰化的关系
乳酰化占据了赖氨酸上的羟基，因此理论上它应该阻止其他酰化的发生，例如乙酰化；同样，乙酰化也可能干扰同一位点的乳酰化
事实上，我们发现 p53K120 Lac、p53K139 Lac 和 p53Dual Lac 在体外和体内都不能在修饰位点乙酰化
同样，p53K120 Ac、p53K139 Ac和p53Dual Ac的位点特异性乙酰化（图S11H-S11J）也抑制了相应位点的乳酰化
表明 p53 乳酰化的生化后果，即通过乙酰化防止 p53 激活
AARS1 直接与乳酸结合并以 ATP 依赖性方式促进赖氨酸乳酰化
从细菌中纯化的 EcAlaRS 和 HsAlaRS 结合乳酸
酸-EcAlaRS和乳酸-HsAlaRS的解离常数（Kd）分别约为13 mM和35 mM（图3A），表明EcAlaRS和HsAlaRS与乳酸亲和力高，可以使用乳酸作为底物直接催化乳酰化
β-丙氨酸-EcAlaRS 和 β-丙氨酸-HsAlaRS 的 Kd 分别为 2.7 mM 和 4.0 mM
β-丙氨酸可以有效减少乳酸-EcAlaRS和乳酸HsAlaRS之间的结合
β-丙氨酸可以抑制赖氨酸乳酰化
确定 AARS1（HsAlaRS）与乳酸结合的位点
乳酸分子对接 HsAlaRS 晶体结构： 将乳酸分子与 HsAlaRS 的晶体结构进行对接，并发现乳酸分子与 Ala-SA（赖氨酸-丙氨酸核苷酸类似物）的丙氨酸部分重叠
由于乳酸分子与丙氨酸部分重叠，推测乳酸在与 HsAlaRS 结合时，可能占据了与丙氨酸相同的结合位点
类似地，结构对接分析也支持了 EcAlaRS（细菌 AARS1 同源物）的乳酸结合能力
对接模型中，HsAlaRS 和 EcAlaRS 中的几个保守氨基酸残基（HsAlaRS 中的 M46, R77, N216 和 D239；EcAlaRS 中的 M43, R69, W170 和 N212）与乳酸形成直接接触，这些残基被认为是乳酸结合位点
测试 AARS1 是否直接催化赖氨酸乳酰化
只有在向反应中添加乳酸和 ATP 后，EcAlaRS-WT 才会增强细胞裂解物中的整体赖氨酸乳酰化，而缺乏乳酸或 ATP 结合的突变体（分别为 EcAlaRS-6A 或 EcAlaRS-R69A&G239A）则不会
一些合成酶具有编辑活性，可通过水解错误激活或错误充电的氨基酸来避免误译
EcAlaRS-C666A（一种编辑活性降低的突变体）24 在促进乳酰化方面具有与 EcAlaRS-WT 相似的效率（图 3H），表明 不需要进行编辑活动
类似地，HsAlaRS-WT和HsAlaRS-C723A（与AlaRS-C666A同源），但不是乳酸或ATP结合缺陷的突变体（HsAlaRS-5A或HsAlaRSR77A＆G243A）（图S5I），增加了赖氨酸乳酰组
EcAlaRS 或 HsAlaRS 的乳酰化催化活性可以被 β-丙氨酸阻断
为了确认 AARS1 催化乳酰基转移
孵育 HsAlaRS、乳酸和 ATP 以引发反应，然后用旋转脱盐柱去除 HsAlaRS，仅当添加回 HsAlaRS 蛋白时才观察到细胞裂解物的乳酰化
这一发现排除了 AARS1 产生的中间体可能扩散到溶液中并非特异性修饰赖氨酸的可能性，从而确定了 AlaRS 将乳酰基部分转移到赖氨酸中的必要性
使用质谱 (MS) 来表征 EcAlaRS 依赖性赖氨酸乳酰基组
包括 1,704 个具有不同亚细胞分布的蛋白质的 4,544 个 Klac 位点
801 个 (47%) 包含单个 Klac 位点，而 48 个 (2.8%) 包含 10 个以上
当将 Klac 位点周围的氨基酸序列与人类蛋白质组背景进行比较时，我们发现大多数位置明显偏爱带正电的赖氨酸，而半胱氨酸和亮氨酸的代表性不足
通过催化 ATP 依赖性乳酸-AMP 的形成，AARS1 将乳酸转移至赖氨酸的共价键上
AARS1 与其他成熟的蛋白质一起作为 p53 结合伙伴
HsAlaRS 和 EcAlaRS 在体外直接与 p53 结合
p53-HsAlaRS 和 p53-EcAlaRS 的 Kd 分别达到 39 mM 和 21 mM（图 4C 和 S6C），接近它们对乳酸的亲和力
HsAlaRS 和 p53 之间在多种细胞类型和内源水平上的相互作用
p53 在赖氨酸 120 (K120) 和赖氨酸 139 (K139) 处被乳酸化
评估了耗尽所有与 p53 相互作用的 ARS 对 p53 活性的影响。 只有来自AARS1耗尽的细胞的裂解物未能乳化或灭活p53（图4J），表明AARS1是p53的主要乳酰转移酶
在细胞中，共表达 HsAlaRS-WT，但不是 HsAlaRS-5A 或 HsAlaRSR77A&G243A，有效乳化 p53，并且这被 β-丙氨酸抵消
siRNA 介导的敲低或单等位基因缺失来消除 AARS1 会抑制宿主细胞对乳酸诱导的 p53 乳酰化的反应，进一步证实 AARS1 介导 p53 乳酰化
EcAlaRS-WT 或 HsAlaRS-WT，在 K120 和 K139 处乳酸化 p53； 这些反应被 β-丙氨酸抑制
乳酸在AARS1介导的乳酰化中的作用应该类似于L-丙氨酸在氨酰化中的作用
首先乳酸在AARS1中被ATP分子激活，从而形成 含有活性乳酰磷酸键的中间产物乳酸-AMP，以及无机焦磷酸盐（PPi）的释放
其次，活化的乳酸共价连接到赖氨酸受体末端，同时释放 AMP
用 EcAlaRS-WT 或 HsAlaRS-WT 孵育乳酸和 ATP 后检测到乳酸-AMP 的形成和 PPi 的释放，但与乳酸或 ATP 结合缺陷突变体未检测到
向反应中添加底物 p53 会导致乳酸-AMP 的消耗，同时产生 AMP
总之，我们推断 AARS1 是一种进化上保守的酶，催化 ATP 依赖性乳酸-AMP 的形成，通过这种酶，乳酸可以共价转移到目标蛋白的赖氨酸上
p53 的位点特异性乳酰化减弱其 DNA 结合和液-液相分离 (LLPS)，从而降低 p53 在体外和体内的肿瘤抑制作用
位于 DNA 结合域 (DBD) 中的 K120 和 K139 的乳酰化如何抑制 p53 活性
p53 具有本质上无序的结构域，并且研究表明p53 可以经历LLPS
在细胞中，p53 puncta 可以被基因毒性剂丝裂霉素 C (MMC) 诱导，并被 5% 1,6-己二醇 (Hex)（一种破坏弱疏水相互作用的化合物）破坏，表明激活的 p53处于相分离状态
在邻近连接试验 (PLA) 中，内源性 p53 在用基因毒性剂或草酸盐刺激后表现出核斑点，因此，p53 经历 LLPS，在激活后形成核凝聚物
DBD 耗尽的突变体 (d-DBD) 显示出非常低的 LLPS
p53 与 p53RE-DNA 的结合促进 LLPS，这是由 DBD 介导的
将 p53-DBD 与 mCherry-Cry2（一种光敏蛋白，当暴露于蓝光时可自组装以促进 LLPS）融合， 导致细胞中快速的蓝光依赖性聚类和斑点形成
因此，DBD 对于 p53 在细胞中有效执行 LLPS 是必需的
与非乳酰化 p53 (p53Non Lac) 相比，p53K120 Lac、p53K139 Lac 和 p53Dual Lac（统称为 p53Lac）对 p53RE-DNA 的亲和力分别降低约 100、10 和 1,000 倍
p53Non Lac 在与 p53RE-DNA 形成液滴方面比 p53Lac 变体更有效
后者在 LCA 测试中的活性低于 p53Non Lac
表明 DBD 中的 p53 乳酰化消除了其 LLPS 和转录活性
在细胞中验证这些体外研究结果
在 p53/细胞中表达 FlagLac-p53 (p53-WT) 和 Flag-p53Lac (p53K120 Lac、p53K139 Lac 或 p53Dual Lac) 的影响
Flag-p53Lac 蛋白未能结合 p53RE-DNA，也不能在刺激下凝结成离散的核点（图 5J 和 5K），并且在驱动 p53 响应报告基因和靶基因的表达方面效率低下
p53-DBD-WT（而非 p53-DBDLac）与 mCherry-Cry2 的融合使得蓝光诱导细胞中斑点形成（图 5M abd S10H），证实乳酰化也损害了细胞中的 LLPS
p53Dual Lac 比 p53WT 更具致瘤性
p53 K120 和 K139 乳酰化水平与肿瘤体积相关
β-丙氨酸可以拮抗肿瘤生长中AARS1介导的p53乳酰化
AARS1 表达在许多肿瘤类型中升高，并且与 WT p53 患者的较差生存率相关
AARS1-WT 功能的获得（而非 AARS1-5A）抑制了体外和细胞内 p53 的活性
shRNA靶向AARS1-30非翻译区（UTR）的效果可以通过AARS1-WT的异位表达来挽救，但不能通过AARS15A来挽救
评估MMTV-PyMT 动物中 AARS1 表达减少的影响，特别是在乳腺上皮中单等位基因删除了 AARS
AARS1 减少的 MMTV-PyMT 小鼠比野生型同窝小鼠更晚出现肿瘤，并且表现出原发肿瘤负荷减少
在 Aarsfl/+ Cre- MMTV-
PyMT 小鼠中，肿瘤乳酸浓度与肿瘤负荷呈显着的正相关，但在 Aarsfl/+ Cre+ MMTV-PyMT小鼠中则不然
Aarsfl/+ Cre+ MMTV-PyMT 小鼠肿瘤中 K120 和 K139 处的 p53 乳酰化减少（图 7F），并且从 Aarsfl/+ Cre+ 肿瘤中分离的细胞对乳酸介导的 p53 抑制反应较差
这些发现表明 AARS1 在体内介导 p53 失活并有助于肿瘤发生
研究结果的临床相关性
对肿瘤切片和邻近正常组织进行免疫组织化学 (IHC)
AARS1 以及蛋白质组 (lactyl-K) 和 p53 (lactylp53 K120) 的乳酰化在恶性肿瘤中均显着上调
TCGA 脑肿瘤中，AARS1 表达也与 p53 活性显着呈负相关
在人类癌症中，包括乳酰化 p53 在内的整体赖氨酸乳酰化受到 AARS1 的调节
β-丙氨酸治疗可适度抑制细胞增殖、克隆形成和异种移植瘤生长
阿霉素 (Dox) 是一种激活 p5350-52 的基因毒性癌症药物，可增强这些作用
β-丙氨酸治疗小鼠的肿瘤显示 p53 乳酰化减少，而 β-丙氨酸加 Dox 治疗的小鼠的肿瘤显示出显着延长的寿命
推断 β-丙氨酸可以防止 p53 的乳酰化依赖性失活，表明其治疗潜力
讨论
肿瘤细胞经常重新编程其新陈代谢以增加乳酸的产生
肿瘤来源的乳酸通过乳酰化作用拮抗 p53
AARS1（一种以其在蛋白质翻译中的作用而闻名的古老酶）作为乳酸传感器和负责整体赖氨酸乳酰基转移酶
p53 DBD 中的两个残基 K120 和 K139 作为 AARS1 的真正靶标，并证明乳酰化会阻断 p53 LLPS、与 DNA 的结合以及其靶基因的诱导，从而促进肿瘤发生
一般来说，需要两种或多种酶来催化蛋白质酰化，本研究中发现的乳酰化是由单一酶（进化上保守的 AARS1）介导的
ARS 可能无法区分其同源氨基酸，从而导致错误的氨基酸掺入
AARS1 负责大量其他蛋白质的乳酰化
AARS1 底物富含参与核糖体生物发生、RNA 剪接和染色质重塑的蛋白质，并且其他底物的乳酰化也可能有助于肿瘤发生
总体而言，目前的研究结果表明，AARS1 是一种乳酸传感器和乳酰转移酶，在整体赖氨酸乳酰化中发挥着主导作用