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Sequenciamento - Coggle Diagram

- - - - ainda usa a degradação química do DNA, contudo utiliza um nucleotídeo modificado (Didesoxirribose). Possui 3 etapas
        
        Síntese enzimática (PCR)
        
        desnaturação: separação da dupla fita
        
        Adiciona um primer marcado radiotivamente
        
        vai na porção 5' do DNA: marcados p³² ou S³5 - para saber onde começa a síntese
        
        As fitas simples são separadas em 4 tubos e em cada tubo é adicionado apenas um tipo de ddNTP's + DNA-polimerase + dNTP's + cofator da polimerase + tampão
        
        DNA - polimerase I modificada (fragmento de Klenow)
        
        Essa polimerase tem 3 atividades
        
        Exonuclease: 3' - 5' (2/3)
        
        Exonuclease: 5' - 3' (1/3)
        
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        síntese: 5' -3' (1/3)
        
        DNA -polimerase do Fago 7 também pode ser usada
        
        a fita é interrompida sempre que aparecer um didesoxirribonucleotídeo, formando fragmentos de vários tamanhos
        
        Didesoxirribonucleotídeo: nucleotídeo modificado, sem a OH do carbono 5', isso impede a ligação fosfodiester com o próximo nucleotídeo
        
        Análise de fragmentos
        
        Eletrofose em gel
        
        poliacrilamida
        
        fragmentos menores correm mais no gel
        
        fragmentos são separados quimicamente
        
        mesmo método de Maxam/Gilbert
        
        Uso de fluorescência para visualizar
        
        Automatização
        
        adicionado um cromatograma
        
        acoplado a eletroforese
        
        fluoróforos
        
        permite a leitura simultânea
        
        cada nucleotídeo emita uma luz em uma onda específica
        
        permite diferenciá-los