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Western Blot - Coggle Diagram
Western Blot
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Transferência
Contato direto entre o gel e uma membrana, sob aplicação de um campo elétrico, num ambiente imerso em tampão básico
Montagem do "sanduíche" → de baixo para cima: esponja, gel, membrana, gel
Capilaridade do gel permite que o tampão entre nos poros e remova as proteínas para a membrana, mantendo-as separadas
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Nitrocelulose (baixo custo) ou PVDF (maior sensibilidade, capacidade de ligação com as proteínas, tempo de retenção, ativada com metanol)
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Incubação com Anticorpos
Bloqueio com leite: cobre as regiões da membrana que não possuem as proteínas submetidas à eletroforese, evitando ligações inespecíficas do anticorpo
Anticorpo primário: reagir com um epítopo da proteína, formando um complexo anticorpo-antígeno; o Ac. primário é específico para a proteína de interesse (overnight)
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Lavagem: com o tampão de lavagem para retirar todo o anticorpo que não está especificamente ligado a proteína de interesse
Anticorpo secundário: anti-IgG, ou seja, é um anticorpo que reconhece um anticorpo; o Ac. secundário é específico para a espécie animal na qual foi desenvolvido o anticorpo primário
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Princípio
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Sequências de aminoácidos variam de acordo com a proteína → identificação e quantificação de uma proteína específica em meio a milhares de outros
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Eletroforese
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O tamanho dos poros do gel pode ser ajustado variando a concentração da acrilamida adicionada para retardar a migração da sua proteína de interesse
Revelação
Quimioluminescência: incubação da membrana com substrato que emite luz após a reação com a enzima reveladora
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Stripping → para fazer uma nova incubação: membrana é colocada em um tampão ácido para dissociar os anticorpos primário e secundário da proteína de interesse
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Colorimétrica: incubação da membrana com substrato que reaja com a enzima reveladora, como a peroxidase, que está conjugada ao anticorpo secundário
Conversão do corante solúvel em insolúvel, colorindo a membrana e gerando as bandas
Após a lavagem para a remoção do corante, a expressão proteica é analisada por densitometria
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Fluorescente
Não necessita de substratos enzimáticos, pois o anticorpo secundário está acoplado a uma sonda fluorescente
Quando excitada no comprimento de onda apropriado, esta sonda emite a fluorescência que é captada por um fotossensor, como uma câmera CCD
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Aplicação Clínica
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Toxoplasmose congênita → ainda não é bem estabelecido na literatura o uso da técnica para investigar essa infecção