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ALCUNE APPLICAZIONI DELLA PCR - Coggle Diagram
ALCUNE APPLICAZIONI DELLA PCR
INTRO
LE MAPPE GENICHE SONO DI FONDAMENTALE IMPORTANZA PER LA REALIZZAZIONE DEL PROGETTO GENOMA UMANO,
CHE SI PROPONE LA MAPPATURA DELL’INTERO PATRIMONIO GENETICO DELLA SPECIE UMANA.
L’AMPLIFICAZIONE DEL DNA TRAMITE PCR È UNA TAPPA OBBLIGATA DI QUASI TUTTE LE METODICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE,
QUALI LA RICERCA DI MUTAZIONI, IL CLONAGGIO, L’ANALISI DI MARCATORI GENETICI POLIMORFICI, L’IDENTIFICAZIONE DI TRASLOCAZIONI CON SIGNIFICATO DIAGNOSTICO E PROGNOSTICO.
NELLO STUDIO DELLA FUNZIONE DEI GENI, SI UTILIZZA LA PCR X OTTENERE NUMEROSE COPIE DI 1 STESSO GENE E RENDERE + FACILI LE INDAGINI SUCCESSIVE.
I TEST DI SCREENING SI AVVALGONO DEI PRODOTTI DELLA PCR DI DNA ESTRATTO DA:
TESSUTI FRESCHI O COLTURE CELLULARI O LIQUIDI BIOLOGICI E PROCESSATI TRAMITE
DHPLC
E TESSUTI INCLUSI IN PARAFFINA
IN BIOLOGIA, LA PCR HA PERMESSO DI CHIARIRE LA FUNZIONE DI MOLTI GENI, DI ESEGUIRE MAPPE GENETICHE,
CIOÈ DI INDIVIDUARE LA SEQUENZA E LA DISTANZA FRA GENI, E DI CONDURRE STUDI SUI PROCESSI EVOLUTIVI.
DENATURING GRADIENT GEL ELECTROPHORESIS (DGGE)
TALE VARIAZIONE PUÒ ESSERE CONTROLLATA SU UN GEL DI POLIACRILAMIDE A CONCENTRAZIONE CRESCENTE DI DENATURANTI,
POICHÈ IL RAGGIUNGIMENTO DELLA CONCENTRAZIONE OTTIMALE DI DENATURAZIONE COMPORTA UNA PARZIALE APERTURA DELLA DOPPIA ELICA E,
QUINDI, UN RALLENTAMENTO NELLA PROGRESSIONE DEL FRAMMENTO SUL GEL.
TALE PATTERN È GENERALMENTE PECULIARE PER OGNI SINGOLA MUTAZIONE.
È UNA TECNICA CHE SI BASA SUL PRINCIPIO CHE ANCHE UNA SINGOLA VARIAZIONE DI SEQUENZA PUÒ MODIFICARE LA CONCENTRAZIONE DI DENATURANTE NECESSARIA ALL’APERTURA DI UN DETERMINATO SEGMENTO DI DNA
PROTEIN TRUNCATION TEST (PTT)
DATO CHE IL METODO PERMETTE DI ANALIZZARE REGIONI DI DNA + LUNGHE RISPETTO ALLA SSCP STA DIVENTANDO UN UTILE METODO DI SCREENING INIZIALE
PRIMA DI PROCEDERE AI METODI CON MAGGIORE EFFICIENZA DI RILEVAZIONE.
E’ UN METODO DI SCREENING CHE PERMETTE DI IDENTIFICARE MUTAZIONI CHE PROVOCANO IL BLOCCO DELLA TRADUZIONE,
GRAZIE ALLA RILEVAZIONE DI PROTEINE TRONCATE SU GEL.
DHPLC
(DENATURING HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY)
LA MISCELA VIENE, QUINDI, SOTTOPOSTA A RINATURAZIONE A T OTTIMALI LE BASI MALE APPAIATE NEGLI HETERODUPLEX COMINCIANO A SEPARARSI,
MENTRE QUELLE BEN APPAIATE NEGLI HOMODUPLEX RIMANGONO INTATTE.
DHPLC
È CAPACE DI IDENTIFICARE SINGOLE SOSTITUZIONI NUCLEOTIDICHE O PICCOLE INSERZIONI/DELEZIONI IN REGIONI AMPLIFICATE DI UN GENE;
SI BASA SUL MAGGIOR TEMPO DI RITENZIONE DEGLI HOMODUPLEX RISPETTO AGLI HETERODUPLEX.
IN TAL MODO, GLI HETERODUPLEX VENGONO ELUITI RISPETTO AGLI HOMODUPLEX A CONCENTRAZIONI + BASSE DELLA FASE ORGANICA, CHE ROMPE LE INTERAZIONI TRA I FRAMMENTI DI DNA.
È UNA TECNICA CHE, IN CONDIZIONI PARZIALMENTE DENATURANTI E SOTTO UN DIRETTO CONTROLLO DELLA TEMPERATURA,
PERMETTE DI DISCRIMINARE ALL’INTERNO DI PRODOTTI ETEROGENEI DI PCR MOLECOLE DI DNA HETERODUPLEX
(CONTENENTI UN ALTERATO APPAIAMENTO DI BASI) RISPETTO ALLE MOLECOLE HOMODUPLEX (APPAIAMENTO CORRETTO).
IL DNA AMPLIFICATO, DOPO DENATURAZIONE, VIENE MISCELATO CON UN CAMPIONE DI DNA WT
ALLO SCOPO DI CONSENTIRE LA FORMAZIONE DI HETERODUPLEX NEL CASO IN CUI FOSSERO PRESENTI HOMODUPLEX CON MUTAZIONI, CHE, ALTRIMENTI, SFUGGIREBBERO AL RILEVAMENTO.
CONSTANT DENATURING GEL ELECTROPHORESIS (CDGE)
LA CONCENTRAZIONE DI DENATURANTE CHE PERMETTE UNA RISOLUZIONE OTTIMALE, PREVENTIVAMENTE DETERMINATA MEDIANTE LA DGGE,
VIENE IN QUESTO CASO TENUTA COSTANTE.
DOPO CHE UNA MUTAZIONE È STATA IDENTIFICATA, QUESTA TECNICA PERMETTE DI VERIFICARE LA SUA PRESENZA IN UN GRANDISSIMO NUMERO DI CAMPIONI.
TEMPORAL TEMPERATURE GRADIENT GEL ELECTROPHORESIS (TTGE)
SFRUTTA I PRINCÌPI DELLA DDGE SENZA USARE AGENTI CHIMICI X CREARE NEL GEL UN AMBIENTE DENATURANTE,
MA BASANDOSI SUL DIVERSO COMPORTAMENTO DI MELTING DEL DNA WT E MUTATO IN PRESENZA DI UN GRADIENTE TEMPORALE DI TEMPERATURA,
CHE VIENE AUMENTATO GRADUALMENTE IN MODO LINEARE DURANTE L’ELETTROFORESI.
ANALISI DEGLI ETERODUPLEx (HETERODUPLEX ANALYSIS – HA)
LE MOLECOLE ETERODUPLEX ANCHE CON UN SOLO MISAPPAIAMENTO POSSONO MOSTRARE DIVERSA MOBILITÀ RISPETTO AGLI OMODUPLEX
SE VENGONO FATTE CORRERE IN UN GEL DI POLIACRILAMIDE NON DENATURANTE.
QUESTA TECNICA VIENE SPESSO USATA CON LA SSCP PER MIGLIORARNE LA SENSIBILITÀ.
CONSISTE NELLA FORMAZIONE DI ETERODUPLEX DNA WILD TYPE/DNA MUTANTE O DURANTE LA PCR O LASCIANDO IBRIDIZZARE I PRODOTTI DENATURATI DI 2 PCR DIFFERENTI.
5 SINGLE-STRAND CONFORMATION POLIMORPHISM
SE SONO ABBASTANZA CORTE, LE MOLECOLE DI DNASS ASSUMERANNO CONFORMAZIONI SECONDARIE DIFFERENTI,
NEL CASO CHE LA LORO SEQUENZA SIA DIVERSA (ANCHE SOLO PER UNA SINGOLA BASE), ED AVRANNO QUINDI UNA DIVERSA MOBILITÀ ELETTROFORETICA.
L’EFFICIENZA È DELL’80% PER FRAMMENTI MINORI DI 200 BP E DEL 60-70% PER FRAMMENTI DI 300-400 BP.
IL DNA WT E QUELLO IN ANALISI, POTENZIALMENTE MUTANTE, SONO AMPLIFICATI VIA PCR, DENATURATI E CORSI L’UNO ACCANTO ALL’ALTRO SU UN GEL DI POLIACRILAMIDE NON DENATURANTE.
QUANTO + AUMENTANO LE DIMENSIONI DI UN FRAMMENTO DI DNA, TANTO + DIVENTA DIFFICILE EVIDENZIARNE LE DIFFERENZE DI MOBILITÀ.
MULTIPLEX LIGATION-DEPENDENT PROBE AMPLIFICATION (MLPA)
RILEVA UN ABERRANTE NUMERO DI COPIE DI SEQUENZE TARGET DIVERSE DI DNA GENOMICO /
DISCRIMINA SEQUENZE CHE DIFFERISCONO PER UN SOLO NUCLEOTIDE
DISCRIMINA MOLTEPLICI MRNAS DIVERSI./
DETERMINA LO STATO DI METILAZIONE DEI PROMOTERS.
RAPPRESENTA UNA VARIAZIONE DELLA PCR CHE PERMETTE L’AMPLIFICAZIONE DI MOLTEPLICI TARGETS CON UNA SINGOLA COPPIA DI PRIMERS.
FASI: DENATURAZIONE, IBRIDIZZAZIONE, LIGAZIONE E AMPLIFICAZIONE