TIPOS DE PCR
RAPD
Random Amplified Polymorphic ADN
PRIMERS
Inespecíficos
Pequeños
Baja tª de hibridación
inespecificidad
problemas e reproducibilidad
10 nucleótidos
mayores sitios de hibridación
muchos amplicones
amplia representación del genoma
Detecta SNP
solo si esta en el sitio de reconocimiento del primer
Identificar mutagénesis
no reconoce una mutación específica
-
Se necesita optimizar la reacción de PCR
+
No se necesita conocimiento previo de secuencias de ADN para diseñarlos
PCR-RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism
1) Amplificación por PCR 2) Digestión por endonucleasas de restricción
Detecta SNP
podemos diferenciar los alelos de los genes plimórficos gracias a diferentes endonucleasas
ARMS
Amplification Refractory Mutation System o PCR alelo-específica
Depende del nucleótido que está en 3´del primer
2 PCR por individuo
Genotipado
PCR anidada
Se utiliza cuado hay problemas de especificidad
Se diluyen productos de una reacción de amplificación y se usan como ADN de inicio para una segunda reacción con otros priméis
2 PCR consecutivas
PCR-TI
PCR de transcriptasa inversa
PCR en tiempo real
Cuantitativa
sistema de detección de fluorescencia
+
más sensible
más reproducible y precisa
cuantificación de ADN mediante la Ct
Fluoróforos
no específicos
detectan todos los ADN de doble cadena
específicos
quenchers y sondas marcadas
sondas más utilizadas
TaqMan
Molecular Beacon
Scorpion
PCR digital
La muestra se parte en alícuotas en diferentes pocillos
reacción PCR con sondas TaqMan
Señal
No señal
recuento absoluto de moléculas en la muestra
+
ultrasensible
no necesita muestras de referencia
detecta alelos raros
más sensible