La spettroscopia NMR bidimensionale (2-D) è una tecnica avanzata che consente di ottenere informazioni più dettagliate rispetto alla spettroscopia NMR monodimensionale. Questa tecnica coinvolge due dimensioni di frequenza anziché una sola, fornendo una visione più completa della struttura e delle interazioni molecolari.

Analisi bidimensionale:
Ogni punto nello spettro bidimensionale (chiamato spettro 2-D) corrisponde a una coppia di frequenze (ν1 e ν2), che rappresentano le due dimensioni del grafico. Ogni picco nello spettro 2-D fornisce informazioni sull'interazione tra i nuclei nel campione.
Costruzione dell'immagine 3-D:
Continuando questo processo per tutte le frequenze (ν2) e tutti i tempi di evoluzione (τ2), si ottengono una serie di spettri 2-D. Ogni spettro 2-D rappresenta una "fetta" del campione nelle due dimensioni di frequenza.
Questi spettri 2-D vengono poi combinati per costruire un'immagine tridimensionale (3-D), dove le frequenze di risonanza dei nuclei costituiscono le due dimensioni orizzontali (ν1 e ν2) e l'intensità dei segnali costituisce la terza dimensione (intensità degli spettri).
Questa immagine 3-D può essere visualizzata come una mappa topografica che fornisce una rappresentazione dettagliata della distribuzione delle frequenze di risonanza nel campione.

Tecnica COSY (Correlation Spectroscopy):
Con la tecnica COSY, vengono dati due impulsi a 90° al campione NMR, con un tempo di evoluzione (τ1) tra i due impulsi.
Questo genera una serie di spettri 2-D, dove l'asse x rappresenta le frequenze di un nucleo (ν1) e l'asse y rappresenta le frequenze di un altro nucleo (ν2).
Sulla diagonale dello spettro 2-D, dove ν1 è uguale a ν2, si ottengono le stesse informazioni che si avrebbero con uno spettro NMR monodimensionale.
Fuori dalla diagonale, si ottengono informazioni sulla correlazione tra i diversi nuclei, e quindi tra i diversi gruppi funzionali nella molecola. Due punti diversi sulla diagonale che si collegano con una linea rossa indicano una correlazione tra i due nuclei. In uno spettro COSY, sono visibili solo le correlazioni tra nuclei che sono distanti massimo 5 Ångström.

Tecnica TOCSY (Total Correlation Spectroscopy):
La tecnica TOCSY è una versione più avanzata della COSY, progettata per superare il limite di distanza di 5 Ångström tra i nuclei che possono essere correlati. In questa tecnica, invece di un singolo impulso a 90°, viene utilizzato un treno di impulsi per il secondo impulso a 90°. Il tempo in cui viene dato questo treno di impulsi è definito come tempo di mixing.
Questi impulsi creano uno spin-lock che vincola l'evoluzione della magnetizzazione, consentendo alle correlazioni di estendersi a tutti i nuclei presenti nel sistema di spin. Di conseguenza, nello spettro TOCSY sono visibili molteplici punti che rappresentano le correlazioni tra i nuclei e i gruppi funzionali più lontani. Confrontando i due spettri, COSY e TOCSY, possiamo identificare quali correlazioni sono presenti sia nello spettro COSY (per nuclei più vicini) sia nello spettro TOCSY (per nuclei più lontani).

• accoppiamento protono-carbonio:
  Anche se i segnali di risonanza dei carboni sono deboli, essi sono ancora soggetti all'accoppiamento magnetico con i protoni vicini. Questo significa che, se un protone è accoppiato a un carbonio, la risonanza del protone può influenzare la risonanza del carbonio e viceversa.
• Registrazione dello spettro H-C COSY: Con la tecnica H-C COSY, vengono acquisiti spettri bidimensionali dove un asse rappresenta le frequenze di risonanza dei protoni (^1H) e l'altro asse rappresenta le frequenze di risonanza dei carboni (^13C).
• Correlazione tra segnali: Nello spettro H-C COSY, vengono visualizzate le correlazioni tra i segnali di risonanza dei protoni e dei carboni. Questo consente di identificare quali protoni sono accoppiati con quali carboni nella molecola.

sbobine: La regola di selezione la possiamo descrivere come ΔM=1, dove M è il vettore magnetizzazione macroscopica. Nel livello più alto il vettore è 1, in quello più basso -1 e in quelli intermedi 0. Saranno quindi possibili solo le transizioni sui lati del rombo (frecce blu e arancioni). NON sono osservabili ΔM=0 e ΔM=2 (frecce rossa e nera).

Dobbiamo introdurre anche il concetto di popolazione N. Ad ogni stato è associata una popolazione di sistemi N, uguale per gli stati intermedi e diversa quelli agli estremi.
I due livelli estremi sono però in realtà legati da una relazione: nello stato a maggiore probabilità sono presenti δ in più, ed in quello a minore probabilità δ in meno.
Se perturbo un sistema, annullo la differenza di popolazione tra gli stati αβ e ββ, e tra gli stati αα e βα cioè annullo di fatto la differenza tra le probabilità di vedere quel nucleo nel suo stato parallelo o antiparallelo rispetto allo spin.
In gergo si dice che SATURO la transizione. Se andiamo quindi a utilizzare questo disaccoppiatore, che tende a disaccoppiare l’interazione tra i due sistemi di spin, saturando il sistema impedisco la visualizzazione dei segnali relativi alle precedenti transizioni rendendo possibile solo la visualizzazione della transizione: - ΔM=0 per αβ - βα → questa transizione viene chiamata zero quantica - ΔM=2 per αα - ββ → questa transizione vede due variazioni; quindi, si chiama doppio quantica

alcuni nuclei possono subire una transizione verso uno stato energetico più basso attraverso un meccanismo di rilassamento doppio quantico (W2), mentre altri possono fare lo stesso attraverso un meccanismo di rilassamento zero quantico (W0). Questi due meccanismi sono in competizione dinamica tra loro.

L'effetto Overhauser riflette l'accoppiamento dipolare in un intorno spaziale dei nuclei coinvolti. Questi nuclei non devono essere necessariamente legati chimicamente, ma devono essere vicini nello spazio.

Tempo di correlazione (τc):
rappresenta il tempo necessario affinché una molecola ruoti su se stessa di un radiante nello spazio.
È un descrittore globale del moto molecolare e dipende da vari fattori come la temperatura, il peso molecolare, la viscosità, il pH e i legami idrogeno.
Il tempo di correlazione può essere determinato utilizzando il tempo di rilassamento spin-spin e l'effetto Overhauser relativo a un gruppo funzionale, applicando modelli matematici appropriati.

attraverso lo studio della differenza tra lo spettro dell'interazione complessiva tra i due ed uno spettro derivante dallo schermaggio di un gruppo funzionale della piccola molecola. La differenza tra i due evidenzierà i gruppi coivolti nell’interazione

Costante di accoppiamento e conformazioni molecolari:
La costante di accoppiamento è una misura della distanza tra i picchi di un multipletto nello spettro NMR. Questa costante offre informazioni sulla media pesata delle conformazioni molecolari presenti in soluzione. Le conformazioni molecolari possono essere differenti conformazioni che la molecola può assumere a causa della rotazione intorno ai suoi legami chimici. Queste conformazioni sono rappresentate dalle frazioni molari P1, P2 e P3, che indicano la proporzione di ciascuna conformazione presente nella soluzione.

Applicazione del disaccoppiatore e segnale dell'acqua:
Il disaccoppiatore è un dispositivo utilizzato per eliminare o "sopprimere" determinati segnali nello spettro NMR.
Ad esempio, nel caso del segnale dell'acqua, che appare a 4.7 ppm, il disaccoppiatore può essere utilizzato per sopprimere questo segnale, consentendo una migliore risoluzione degli altri picchi nello spettro.

In questo caso prendiamo in considerazione il volume sotteso ai picchi in uno spettro bi-dimensionale.
Queste intensità potrebbero essere la differenza tra i volumi dei cross-pick normali e quelli con schematura.
Introduciamo la curva di build up: questa curva ci mostra come varia l’intensità dei cross-pick al variare del tempo di mixing; vediamo che le due grandezze sono correlate.
Il grafico mostra come varia l’intensità del picco (volume sottesa al picco) in base alla distanza tra gli atomi. Ho bisogno di un tempo di mixing alto per apprezzare la differenza tra protoni a diverse distanze (come si vede); il tempo di mixing necessario per apprezzare queste differenze dipende dalla dimensione della molecola.

Nelle molecole complesse come gli amminoacidi, le tecniche NMR come COSY, TOCSY e NOESY sono utilizzate per studiare la struttura e le interazioni molecolari.
Attraverso la COSY e la TOCSY, è possibile rilevare le connessioni tra gruppi funzionali vicini, consentendo di identificare gli amminoacidi in una catena peptidica. Con lo spettro NOESY, invece, è possibile apprezzare distanze maggiori e determinare la sequenzialità della proteina, identificando le interazioni tra gli atomi di idrogeno in gruppi amminici successivi. Queste informazioni sono cruciali per comprendere la struttura e la funzione delle proteine.

• generazione del campo magnetico variabile: Utilizzando un sistema di bobine, viene generato un campo magnetico variabile progressivo che viene applicato al campione. Questo campo magnetico varia in modo graduale lungo una dimensione spaziale.
• Impulsi e tempo di diffusione: Vengono applicati impulsi NMR al campione, intervallati da un tempo di diffusione specifico. Durante questo tempo, le molecole all'interno del campione si muovono nello spazio a causa della loro diffusione.
• Effetto sulla risonanza NMR: A causa della diffusione delle molecole, ciò comporta una variazione nella velocità con cui le molecole "vedono" il campo magnetico. Questa variazione di velocità influisce sull'intensità dei picchi nello spettro NMR.
• Analisi dei dati: Analizzando l'intensità dei picchi nello spettro NMR ottenuto, è possibile ottenere informazioni sulla mobilità delle molecole nel campione. Le molecole che si diffondono più rapidamente mostreranno un allargamento maggiore dei picchi, mentre quelle che si diffondono più lentamente mostreranno un allargamento minore.
• Localizzazione spaziale: Utilizzando la tecnica DOSY in tre dimensioni, è possibile localizzare i segnali delle molecole all'interno di un volume di campione, consentendo di ricostruire la posizione tridimensionale degli elementi all'interno del sistema.

Misurazione dell'attenuazione del segnale:
La presenza di autodiffusione delle molecole d'acqua porta a una perdita di coerenza del segnale NMR, che si riflette in una riduzione dell'intensità dell'eco ottenuto. Questo è dovuto al fatto che le molecole d'acqua in movimento causano una distribuzione più ampia delle frequenze di risonanza.
Misurando l'attenuazione del segnale rispetto al tempo, possiamo ottenere informazioni sull'autodiffusione delle molecole d'acqua nel sistema.

Calcolo del rapporto di attenuazione R:
Utilizzando i dati sperimentali ottenuti, è possibile calcolare il rapporto di attenuazione R, che è definito come il rapporto tra l'intensità dell'eco con gradienti di campo magnetico e l'intensità dell'eco senza gradienti di campo magnetico.
Il logaritmo naturale di R fornisce informazioni sull'autodiffusione delle molecole d'acqua nel sistema, consentendo di separare questo contributo dal rilassamento del sistema.

riassunto : utilizzo dei gradienti di campo magnetico durante una sequenza CPMG consente di separare il contributo dell'autodiffusione delle molecole d'acqua dal rilassamento del sistema, permettendo così di ottenere informazioni specifiche sull'autodiffusione nelle risonanze NMR.