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(SPRETTROSCOPIA BIDIMENSIONALE) - Coggle Diagram

- - - - accoppiamento protono-carbonio:
        Anche se i segnali di risonanza dei carboni sono deboli, essi sono ancora soggetti all'accoppiamento magnetico con i protoni vicini. Questo significa che, se un protone è accoppiato a un carbonio, la risonanza del protone può influenzare la risonanza del carbonio e viceversa.
        
        Registrazione dello spettro H-C COSY: Con la tecnica H-C COSY, vengono acquisiti spettri bidimensionali dove un asse rappresenta le frequenze di risonanza dei protoni (^1H) e l'altro asse rappresenta le frequenze di risonanza dei carboni (^13C).
        
        Correlazione tra segnali: Nello spettro H-C COSY, vengono visualizzate le correlazioni tra i segnali di risonanza dei protoni e dei carboni. Questo consente di identificare quali protoni sono accoppiati con quali carboni nella molecola.
  - - - L'effetto Overhauser può essere utilizzato per studiare le interazioni tra molecole, come nell'interazione tra macromolecole e piccole molecole.
        Questo può essere utile nel comprendere le interazioni molecolari e nella determinazione delle distanze tra i nuclei di idrogeno all'interno delle molecole.
        Inoltre, il tempo di correlazione (τc), che rappresenta il tempo necessario per una molecola per ruotare su se stessa, può essere determinato utilizzando l'effetto Overhauser e applicando modelli matematici appropriati.
        
        L'effetto Overhauser riflette l'accoppiamento dipolare in un intorno spaziale dei nuclei coinvolti. Questi nuclei non devono essere necessariamente legati chimicamente, ma devono essere vicini nello spazio.
        
        Tempo di correlazione (τc):
        rappresenta il tempo necessario affinché una molecola ruoti su se stessa di un radiante nello spazio.
        È un descrittore globale del moto molecolare e dipende da vari fattori come la temperatura, il peso molecolare, la viscosità, il pH e i legami idrogeno.
        Il tempo di correlazione può essere determinato utilizzando il tempo di rilassamento spin-spin e l'effetto Overhauser relativo a un gruppo funzionale, applicando modelli matematici appropriati.
        
        attraverso lo studio della differenza tra lo spettro dell'interazione complessiva tra i due ed uno spettro derivante dallo schermaggio di un gruppo funzionale della piccola molecola. La differenza tra i due evidenzierà i gruppi coivolti nell’interazione
        
        calcolo delle distanze tra idrogeni:
        L'effetto Overhauser può essere utilizzato percalcolare le distanze tra i nuclei di idrogeno all'interno di una molecola. Utilizzando due idrogeni di un gruppo CH2 come standard interno, è possibile determinare le distanze con altri idrogeni, fungendo da "righello interno".
        
        Esperimento NOESY e calcolo delle distanze interprotoniche:
        L'esperimento NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy) è utilizzato per calcolare le distanze interprotoniche all'interno di una molecola.
        Utilizzando le informazioni sui picchi in uno spettro bidimensionale, è possibile determinare le distanze tra i nuclei di idrogeno attraverso la relazione data.
        
        Esperimento NOESY e calcolo delle distanze interprotoniche: In un esperimento NOESY, si somministrano tre impulsi ai campioni: due impulsi a 90° intervallati da un tempo di attesa (t1), seguiti da un tempo di mixing e infine un terzo impulso a 90°. Durante il tempo di mixing, il sistema si rilassa e fornisce informazioni sulla distanza interprotonica.
        Le distanze interprotoniche possono essere calcolate utilizzando la relazione tra le intensità dei segnali degli accoppiamenti, ottenendo così informazioni sulle distanze tra gli atomi di idrogeno all'interno della molecola.
        
        In questo caso prendiamo in considerazione il volume sotteso ai picchi in uno spettro bi-dimensionale.
        Queste intensità potrebbero essere la differenza tra i volumi dei cross-pick normali e quelli con schematura.
        Introduciamo la curva di build up: questa curva ci mostra come varia l’intensità dei cross-pick al variare del tempo di mixing; vediamo che le due grandezze sono correlate.
        Il grafico mostra come varia l’intensità del picco (volume sottesa al picco) in base alla distanza tra gli atomi. Ho bisogno di un tempo di mixing alto per apprezzare la differenza tra protoni a diverse distanze (come si vede); il tempo di mixing necessario per apprezzare queste differenze dipende dalla dimensione della molecola.
        
        APPLICAZIONE REALE
        
        Nelle molecole complesse come gli amminoacidi, le tecniche NMR come COSY, TOCSY e NOESY sono utilizzate per studiare la struttura e le interazioni molecolari.
        Attraverso la COSY e la TOCSY, è possibile rilevare le connessioni tra gruppi funzionali vicini, consentendo di identificare gli amminoacidi in una catena peptidica. Con lo spettro NOESY, invece, è possibile apprezzare distanze maggiori e determinare la sequenzialità della proteina, identificando le interazioni tra gli atomi di idrogeno in gruppi amminici successivi. Queste informazioni sono cruciali per comprendere la struttura e la funzione delle proteine.
        
        la tecnica DOSY (Diffusion Ordered Spectroscopy) è una tecnica avanzata utilizzata nella spettroscopia NMR per ottenere informazioni sulla mobilità delle molecole all'interno di una soluzione. Questa tecnica sfrutta le differenze nella diffusione delle molecole per separare e identificare i diversi componenti di una miscela.
        
        generazione del campo magnetico variabile: Utilizzando un sistema di bobine, viene generato un campo magnetico variabile progressivo che viene applicato al campione. Questo campo magnetico varia in modo graduale lungo una dimensione spaziale.
        
        Impulsi e tempo di diffusione: Vengono applicati impulsi NMR al campione, intervallati da un tempo di diffusione specifico. Durante questo tempo, le molecole all'interno del campione si muovono nello spazio a causa della loro diffusione.
        
        Effetto sulla risonanza NMR: A causa della diffusione delle molecole, ciò comporta una variazione nella velocità con cui le molecole "vedono" il campo magnetico. Questa variazione di velocità influisce sull'intensità dei picchi nello spettro NMR.
        
        Analisi dei dati: Analizzando l'intensità dei picchi nello spettro NMR ottenuto, è possibile ottenere informazioni sulla mobilità delle molecole nel campione. Le molecole che si diffondono più rapidamente mostreranno un allargamento maggiore dei picchi, mentre quelle che si diffondono più lentamente mostreranno un allargamento minore.
        
        Localizzazione spaziale: Utilizzando la tecnica DOSY in tre dimensioni, è possibile localizzare i segnali delle molecole all'interno di un volume di campione, consentendo di ricostruire la posizione tridimensionale degli elementi all'interno del sistema.
        
        come avviene la separazione tra il contributo del rilassamento del sistema e l'autodiffusione delle molecole d'acqua utilizzando i gradienti di campo magnetico.
        
        Sequenza di impulsi CPMG: Iniziamo con una sequenza di impulsi di tipo Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG), che è una tecnica NMR comunemente utilizzata per misurare i tempi di rilassamento effettivi del sistema. Questa sequenza comprende un impulso iniziale di 90°, seguito da un intervallo di tempo di rilassamento tau, un impulso di 180° e infine un treno di impulsi per misurare l'evoluzione della magnetizzazione nel tempo.
        
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        Proiezione di Newman e costanti di accoppiamento:
        La proiezione di Newman è un modo per visualizzare gli angoli diedri( ovvero gli angoli spaziali tra gli idrogeni di un carbonio) all'interno di una molecola. Le costanti di accoppiamento forniscono informazioni sulla distribuzione dei conformeri molecolari, consentendo di calcolare le conformazioni relative dei legami molecolari.
        
        Vediamo che tra i tre idrogeni possiamo avere le tre diverse condizioni: gli angoli possono essere o entrambi in trans oppure uno in trans e uno in g.
        
        Costante di accoppiamento e conformazioni molecolari:
        La costante di accoppiamento è una misura della distanza tra i picchi di un multipletto nello spettro NMR. Questa costante offre informazioni sulla media pesata delle conformazioni molecolari presenti in soluzione. Le conformazioni molecolari possono essere differenti conformazioni che la molecola può assumere a causa della rotazione intorno ai suoi legami chimici. Queste conformazioni sono rappresentate dalle frazioni molari P1, P2 e P3, che indicano la proporzione di ciascuna conformazione presente nella soluzione.
        
        Applicazione del disaccoppiatore e segnale dell'acqua:
        Il disaccoppiatore è un dispositivo utilizzato per eliminare o "sopprimere" determinati segnali nello spettro NMR.
        Ad esempio, nel caso del segnale dell'acqua, che appare a 4.7 ppm, il disaccoppiatore può essere utilizzato per sopprimere questo segnale, consentendo una migliore risoluzione degli altri picchi nello spettro.
      - Dobbiamo introdurre anche il concetto di popolazione N. Ad ogni stato è associata una popolazione di sistemi N, uguale per gli stati intermedi e diversa quelli agli estremi.
        I due livelli estremi sono però in realtà legati da una relazione: nello stato a maggiore probabilità sono presenti δ in più, ed in quello a minore probabilità δ in meno.
        Se perturbo un sistema, annullo la differenza di popolazione tra gli stati αβ e ββ, e tra gli stati αα e βα cioè annullo di fatto la differenza tra le probabilità di vedere quel nucleo nel suo stato parallelo o antiparallelo rispetto allo spin.
        In gergo si dice che SATURO la transizione. Se andiamo quindi a utilizzare questo disaccoppiatore, che tende a disaccoppiare l’interazione tra i due sistemi di spin, saturando il sistema impedisco la visualizzazione dei segnali relativi alle precedenti transizioni rendendo possibile solo la visualizzazione della transizione: - ΔM=0 per αβ - βα → questa transizione viene chiamata zero quantica - ΔM=2 per αα - ββ → questa transizione vede due variazioni; quindi, si chiama doppio quantica
    - - interpretazione dei livelli energetici e delle transizioni:
        Nei sistemi di spin nucleare, i nuclei possono esistere in diversi stati energetici. In un sistema di due nuclei (alfa e beta), esistono quattro possibili configurazioni energetiche: αα, αβ, βα e ββ. La regola di selezione stabilisce che solo certe transizioni tra questi stati energetici sono permesse. In particolare, le transizioni con un cambiamento di una unità nel vettore di magnetizzazione macroscopica (ΔM = ±1) sono permesse, mentre le transizioni con ΔM = 0 o ΔM = ±2 sono proibite.
        
        sbobine: La regola di selezione la possiamo descrivere come ΔM=1, dove M è il vettore magnetizzazione macroscopica. Nel livello più alto il vettore è 1, in quello più basso -1 e in quelli intermedi 0. Saranno quindi possibili solo le transizioni sui lati del rombo (frecce blu e arancioni). NON sono osservabili ΔM=0 e ΔM=2 (frecce rossa e nera).
      - concorrenza tra meccanismi di rilassamento:
        Quando un sistema è perturbato, come nel caso dell'effetto Overhauser, può avvenire un rilassamento verso uno stato di energia inferiore. Questo rilassamento può avvenire attraverso due meccanismi principali:
        
        Relaxation Zero Quantum (W0): Un meccanismo in cui i nuclei si spostano da uno stato energetico adiacente con ΔM = 0.
        
        Relaxation Double Quantum (W2): Un meccanismo in cui i nuclei passano da uno stato energetico più elevato a uno inferiore con ΔM = ±2.
        
        alcuni nuclei possono subire una transizione verso uno stato energetico più basso attraverso un meccanismo di rilassamento doppio quantico (W2), mentre altri possono fare lo stesso attraverso un meccanismo di rilassamento zero quantico (W0). Questi due meccanismi sono in competizione dinamica tra loro.