Please enable JavaScript.

Coggle requires JavaScript to display documents.

METODI SPETTROSCOPICI E METABOLOMICA - Coggle Diagram

- - - - FUNZIONAMENTO + GRAFICO
        
        Un’onda elettromagnetica, quando attraversa un campione, cede energia ed il fenomeno si traduce in un assorbimento.
        L’assorbimento sposta il sistema ad uno stato energetico superiore.
        Una volta assorbita energia, il sistema lo ricede tramite emissione
        
        Alla transizione del grafico di sinistra, corrisponde il grafico di destra, dove I, nell’asse delle y, è l’intensità del fenomeno in unità arbitraria.
        Inoltre, tramite la formula ΔE=hν possiamo risalire all’energia necessaria per la transizione energetica
        
        ν (mi) = frequenza onda, misurata in cicli per secondo (o Hz)
        
        **h = costante di Planck**
        
        In questo grafico possiamo osservare come il picco sia relativo ad una frequenza energetica specifica.
        L’intensità del fenomeno (che si traduce nella profondità del picco) è proporzionale al numero di sistemi atomici che operano la transizione: più è grande questo numero, più è profondo il picco.
        Sull’asse delle x troviamo la frequenza ν, che è legata al ΔE, quindi alla transizione specifica.
        
        grafico (PAG 1) vediamo come i sistemi associati ad un particolare stato energetico non sono caratterizzati da un’energia esatta, ma possono avere energie diverse, visualizzabili della curva di morse.
        La loro energia dipende dalla distanza tra le masse del sistema, r. masse più vicine hanno associata un’energia più bassa, masse più distanti hanno associata un’energia più alta.
  - - - Per la spettroscopia uv-visibile esistono delle porzioni della molecola responsabili dell’assorbimento, con caratteristiche specifiche nella forma e nella natura dei legami coinvolti.
        Sono quelli che vengono chiamati cromofori.
        Un CH2, ad esempio, che ha un carbonio tetraedrico legato con un legame semplice all’idrogeno, non genera un assorbimento specifico, mentre un frammento CO ha un assorbimento specifico nell’ultravioletto.
        Tecniche come la risonanza magnetica invece non richiedono di individuare dei cromofori o porzioni con caratteristiche di risonanza specifiche.
        
        La spettroscopia UV-Vis è una tecnica in assorbimento ->la variazione registrata dallo spettrofotometro si riferisce alla radiazione assorbita dal campione.
        
        , Lo spettrogramma risultante da un esperimento di questo tipo fornirà sull'asse delle y informazioni qualitative,
        sull'asse delle x informazioni quantitative.
        
        L’informazione quantitativa inoltre è collegata alla legge di Lambert-Beer:
        la relazione lega la variazione dell’intensità dell’onda elettromagnetica alla concentrazione di un campione (tenendo conto del cammino ottico --> lunghezza del campione).
        
        Immaginiamo che sezioni infinitesime del campione vadano ad assorbire l’energia di irradiazione.
        Ogni strato comporta una variazione infinitesima dell’intensità della radiazione, che sarà proporzionale alla concentrazione del campione, al suo spessore e all’intensità della radiazione incidente. Essendo una spettroscopia in assorbimento la variazione è negativa.
        
        Integriamo con separazione delle variabili
        
        l’intensità dell’onda elettromagnetica
        
        la posizione del campione considerato.
        K è la costante per campioni omogenei (la disomogeneità verrebbe mediata nel processo) e può essere tirata fuori dall’integrale
        
        L’integrale di destra è uguale alla lunghezza del campione
        
        Quello di sinistra è uguale al logaritmo del rapporto tra la radiazione emergente e quella incidente
        Ora, gli integrali considerasti nella spettroscopia elettronica sono in base 10 per motivi storici:
        
        ε = coefficiente di estinzione molare del campione
        λ = coefficiente di assorbimento molare.
        
        2 more items...
        
        I cromofori, oltre ad assorbire la luce, in alcune condizioni possono trattenerla e rilasciarla nel tempo, Questi fenomeni di emissione vengono detti di fluorescenza e di fosforescenza. Il fenomeno si sviluppa nel tempo e consiste in una ri-emissione da un livello a più alta energia ad uno a meno alta energia.
        Non tutti i gruppi cromofori possono dare il fenomeno di fluorescenza, solo quelli che hanno una certa polarizzazione di carica (dovuta alla presenza di metalli pesanti. Il tempo che il sistema impiega a decadere è legato ad un fenomeno di primo ordine che può essere rappresentato come la variazione della popolazione del livello a più alta energia
      - ORBITALI MOLECOLARI
        
        π/n/ π sono simboli che descrivono gli orbitali molecolari, che sono un’estensione della teoria dell’orbitale atomico.
        La teoria degli orbitali molecolari *si basa sulla combinazione lineare delle funzioni d’onda che rappresentano gli orbitali atomici.
        La funzione d’onda è una funzione matematica che vuole rappresentare le caratteristiche del sistema atomico o molecolare, legate alla natura del sistema, alla posizione e alla dinamica delle masse che lo costituiscono nel tempo.
        Attraverso le funzioni d’onda si possono descrivere anche le proprietà dei cromofori ed esplicitare le loro caratteristiche collegandole all’esperimento che si sta facendo.
        Quindi si può calcolare un’energia specifica per il livello n o quella per un livello π ed associare, all’esperimento spettroscopico, il salto da un livello elettronico ad un altro.
        
        Dal grafico (PAG 2) vediamo come cambiando solvente in cui è immerso il campione si modificano anche le caratteristiche spettroscopiche della molecola.
        Dal grafico si vede come a seconda che il campione sia immerso o meno in un solvente polare (possibilità di formare legami ad idrogeno e quindi stabilizzare la struttura) l’energia associata ad ogni stato energetico sia diversa.
        Cambiando l’energia associata ad i vari livelli energetici, cambierà anche il ΔE tra il livello all’equilibrio e quello eccitato: se cambia l’energia, cambia anche la posizione della banda.
        Con il diminuire del ΔE diminuisce anche la frequenza d’assorbimento, ed aumenta la lunghezza d’onda (ν è l’inverso di λ), quindi la banda si sposterà verso destra nello spettro.
        
        Energia caratteristica della tecnica UV-visibile: 104-106 cal/mol.
        Aumentando l’energia in gioco, aumenta anche la sensibilità della tecnica.
        Venendo irradiati con alte quantità di energia, i campioni, seppur di minima entità forniranno comunque un segnale.
    - - Quando dobbiamo effettuare una misurazione, dobbiamo prima tracciare una retta di calibrazione di un campione a concentrazione nota.
        La retta si ottiene misurando l'assorbanza di campioni a concentrazione nota e tracciando la retta che rende minima la distanza tra i punti sperimentali (si utilizza il metodo dei minimi quadrati).
        La calibrazione ci permette di ottenerci l’angolo della retta, che corrisponde al nostro ε che utilizzeremo per risalire alla concentrazione del campione.
        
        Se io elaboro una retta di calibrazione soltanto in un determinato intervallo di concentrazione, devo star attento alle misure fatte lontano dall’intervallo stesso, perché sto assumendo la linearità del modello (è una retta) ma questo potrebbe essere valido (con quel particolare coeff. angolare) solo per determinate concentrazioni.
        Quindi, la calibrazione deve essere fatta andando a considerare l’intervallo entro il quale cadono i valori che saranno poi misurati nel campione reale (valori incogniti).
        
        Se ho un cromoforo, che assorbe ad una certa lunghezza d'onda λ1 e un altro cromoforo che assorbe alla lunghezza d’onda λ2 (magari vicina all’altra lunghezza d’onda), la banda che noi effettivamente osserviamo va a convolvere con quest’altra; quindi, in caso di basse concentrazioni le due bande rimangono distinte, ma quando aumenta la concentrazione le due bande cominciano a mescolarsi.
        Di conseguenza, lo spettro risultante diverrà la convoluzione dei diversi contributi dei cromofori.
        
        Di fatto, abbiamo detto che se abbiamo una variabile contro un’altra variabile possiamo fare il metodo di minimi quadrati e individuare il coefficiente angolare caratteristico: effettuiamo una regressione lineare a più variabili per separare il contributo di diverse component
        
        Vi è una correlazione tra le distanze che è mantenuta nel divenire anche se subisce dei cambiamenti.
        Cambia la forma della banda (è allargata) al variare delle concentrazioni delle componenti che la determinano.
        Relazione tra popolazione di stati a e b: Si fa riferimento a una relazione tra il numero di sistemi che si trovano in uno stato "a" rispetto a quelli in uno stato "b". Questa relazione è legata alla popolazione di cromofori in diversi stati.
        Questo rapporto dipende dalla distribuzione normale dei sistemi in più stati di energia, i sistemi si distribuiscono normalmente, ma lo fanno in base alla differenza di energia che li caratterizza. Una distribuzione normale descrive una gaussiana.
        Distribuzione normale dei sistemi in più stati di energia: Si menziona che la distribuzione dei sistemi segue una distribuzione normale o gaussiana. Questo significa che la maggior parte dei cromofori si trova intorno a uno stato energetico medio, ma la distribuzione tiene conto delle differenze di energia tra i vari stati.
  - - - Lo spin nucleare è generato dai protoni e dai neutroni che costituiscono il nucleo.
        Entrambe queste particelle hanno spin 1/2 e si comportano come se fossero in rotazione attorno al loro asse.
        Come gli elettroni negli orbitali atomici, anche i protoni si possono associare in coppie con spin opposto e così pure fanno i neutroni.
        
        In alcuni atomi (come 12C) sia i protoni che i neutroni sono presenti in numero pari e quindi gli spin sono tutti appaiati, uno in opposizione all’altro e il nucleo atomico ha spin risultante I uguale a zero.
        In altri atomi, (come 1H, 13C) o i protoni o i neutroni sono presenti in numero dispari e quindi almeno un nucleone è spaiato e il nucleo ha uno spin risultante I diverso da zero.
        
        regole per determinare lo spin nucleare
        
        1) Se protoni e neutroni sono presenti entrambi in numero pari, il nucleo ha spin zero. Questo si verifica in 12C (6p, 6n) e in 16O (8p, 8n) che hanno I = 0 e quindi hanno un nucleo privo di momento magnetico di spin e non sono osservabili all’NMR.
        
        2) Se protoni e neutroni sono gli uni pari e gli altri dispari, (numero di massa dispari) il nucleo ha spin semi intero (1/2,3/2,5/2, ...) che si ottiene sommando lo spin 1/2 del nucleone spaiato con il suo momento orbitalico.
        Questo si verifica in 1H (1p), 13C (6p, 7n), 15N, 19F, 31P che hanno I = 1/2 e sono i nuclei che vengono più comunemente studiati all’NMR.
        
        Il momento orbitale è una proprietà associata al movimento orbitale di una particella, come ad esempio un elettrone che si muove attorno al nucleo di un atomo. Questa proprietà è importante nella descrizione del comportamento di particelle cariche in campo elettromagnetico, come avviene nei sistemi atomici.
        Quantizzazione: In meccanica quantistica, il momento angolare orbitale è quantizzato, il che significa che può assumere solo valori discreti. Questa quantizzazione è rappresentata dalla regola di quantizzazione di Bohr, che coinvolge il numero quantico orbitale (l).
        Direzione e orientazione quantizzate: Il momento angolare orbitale è un vettore, il che significa che ha una direzione e un'orientazione nello spazio. Questa direzione è indicata dal numero quantico azimutale (m_l).
        Legato alla forma dell'orbitale: Il momento angolare orbitale è collegato alla forma dell'orbitale elettronico. Ad esempio, gli orbitali con valori diversi di l avranno forme diverse.
        
        3) Se protoni e neutroni sono entrambi dispari, il nucleo ha spin intero (1, 2, 3...) che si ottiene sommando lo spin dei due nucleoni spaiati, 1/2 + 1/2, e sommando a questi il loro momento orbitalico (0, 1, 2, 3...). Questo si verifica nel deuterio 2H (1p, 1n) e 14N (7p, 7n) che hanno I = 1 e quindi anche questi sono osservabili all’NMR, anche se i loro spettri sono più complessi
        
        in particolare iprotoni quindi H+ è una proprietà microscopica associabile ad una grandezza macroscopica ovvero il dipolo magnetico cioè se hanno uno spin e noi lo possiamo associare ad un dipolo magnetico lo possiamo andare ad associare un protone comeun dipolo magnetico
        
        quindi : gli atomi di alcuni elementi hanno una caratteristica microscopica chiamata spin. nella pratica lo spin corrisponde alla possibilità di quell'atomo di avere un dipolo (polo nord e sud come le calamite) quindi possiamo rappresentare l'atomo di un alimento in particolare del protone come una calamita che ha una freccia che dal sud va a nord. gli atomi secondo la tecnica NMR sono calamite .
        
        quindi possiamo considerare l'H+ e rappresentarlo con una freccia da sud a nord. per capire l?NMR dobbiamo capire come si comporta atomo quando vine immerso in un campo magnetico esterno:
        
        può disporsi in modo paralleloal campo
        
        oppure antiparallelo
        quindi come si comporta un atomo all'interno del campo magnetico
        
        quindi io mi trovo in un campo magnetico uniforme in cui inserire i miei protone che puo avere due comportamento o antiparallelo o parallelo e avranno una rotazione dei protone alla quale si aggiungerà la stimolazione dei protone con onde elettromagnetiche
      - La legge di Larmor applicata alla spettroscopia NMR afferma che un nucleo atomico con carica elettrica (ad esempio, il nucleo di un atomo di idrogeno) che è posto in un campo magnetico esterno, ruoterà intorno all'asse del campo magnetico a una frequenza specifica, nota come frequenza di Larmor (ω).
        La frequenza di Larmor dipende dal valore del campo magnetico esterno (B0) e dalle proprietà specifiche del nucleo in questione, come il suo momento magnetico
        
        Il momento angolare del nucleo riguarda il movimento rotazionale del nucleo ed è la trasposizione vettoriale del numero quantico di spin I.
        Il momento magnetico intrinseco invece riguarda la proprietà magnetica dei protoni e dei neutroni che compongono il nucleo ed è la somma vettoriale di tutti i loro momenti magnetici
        
        La formula per calcolare la frequenza di Larmor, che corrisponde alla velocità di rotazione del nucleo (ω):
        ω = γB0
        B0 è l'intensità del campo magnetico esterno.
        
        γ è il rapporto giromagnetico del nucleo (una costante specifica per ciascun nucleo). Il rapporto giromagnetico è una costante intrinseca di un nucleo atomico specifico che descrive la sua relazione tra il momento magnetico intrinseco e il momento angolare.
        Il rapporto giromagnetico γ è definito come: γ = μ / I μ è il momento magnetico intrinseco del nucleo, I è il momento angolare del nucleo.
        
        Dividendo la frequenza di Larmor per 2π, otteniamo una frequenza ciclica, che ci permette di lavorare con valori più pratici quando trattiamo le formule dell'NMR:
        
        ν è la frequenza normale (in Hz),
        
        ω è la frequenza di Larmor (in rad/s).
        
        Consideriamo ora il caso più semplice, quello con spin 1/2 di 1H: i due stati possibili del suo nucleo non hanno la stessa energia, ma lo stato con m = +1/2 (allineato al campo) si trova ad energia leggermente più bassa di quello con m = ‒1/2 (opposto al campo).
        Il moto di precessione dei momenti magnetici nucleari avviene con una frequenza ν proporzionale alla differenza di energia tra i due livelli detta frequenza di Larmor data dalla formula:
        
        Il moto di precessione dei momenti magnetici nucleari avviene con una frequenza ν proporzionale alla differenza di energia tra i due livelli detta frequenza di Larmor data dalla formula:
        
        All’aumentare del campo applicato Bo, aumenta la frequenza di Larmor e quindi aumenta la differenza di energia tra i due livelli.
        Poiché, però, questa differenza di energia è piccolissima, dell’ordine di 9 ∙10−6 kcal mol−1, la popolazione di nuclei nei due stati è praticamente identica con una piccolissima prevalenza per lo stato a bassa energia, allineato con il campo.
        Eppure sono proprio questi pochi nuclei in eccesso allineati con il campo magnetico Bo quelli che permettono di generare il segnale NMR.
        Inoltre, la differenza di energia tra i livelli è proporzionale alla frequenza di Larmor e questa è proporzionale al campo applicato Bo.
        
        La magnetizzazione macroscopica è una proprietà collettiva di un materiale in cui un gran numero di nuclei atomici all'interno del materiale si allineano in risposta a un campo magnetico esterno (vediamo in figura come il vettore magnetizzazione sia la sommatoria dei diversi momenti magnetici dei nuclei del campione). Il principio fondamentale dell'esperimento NMR coinvolge la manipolazione della magnetizzazione macroscopica dei nuclei nel campione attraverso l'interazione con campi magnetici esterni e onde radiofrequenza (RF). Il processo di rilassamento della magnetizzazione macroscopica è alla base dell'ottenimento degli spettri NMR, che forniscono informazioni sulle proprietà chimiche e strutturali del campione.
    - - 1- Applicazione del campo magnetico esterno (polarizzazione):
        Il campione viene posto in un forte campo magnetico esterno costante, noto come campo di polarizzazione o campo magnetico statico (B0).
        Questo campo B0 allinea i momenti magnetici dei nuclei del campione nella direzione del campo. In questa fase il segnale associato è 0: il vettore magnetizzazione ha angolo parallelo rispetto al campo magnetico. I nuclei magnetizzati allineati con il campo B0 precessano intorno all'asse del campo magnetico alla frequenza di Larmor (ω), specifica per ciascun tipo di nucleo e proporzionale all'intensità del campo magnetico esterno (B0).
      - 2- Irraggiamento con onde radiofrequenza (RF):
        Viene applicata un'onda radiofrequenza (RF) al campione alla frequenza di Larmor specifica del nucleo che si vuole studiare. Questa RF è pulsata a una frequenza corrispondente alla frequenza di precessione dei nuclei del nucleo target. L'onda RF è in grado di "ribaltare" la magnetizzazione dei nuclei spostandola dal suo allineamento con l'asse z (asse del campo B0) verso il piano trasversale xy
      - 3- Rilassamento:
        Dopo aver applicato l'onda RF, la magnetizzazione dei nuclei inizia a rilassarsi verso l'equilibrio lungo l'asse z. Durante questo processo di rilassamento, i nuclei emettono un segnale radio che viene registrato
        
        TEMPO DI RILASSAMENTO T1 (SPIN-RETICOLO) si esplicita nel recupero della magnetizzazione longitudinale (rispetto all’asse z).
        
        A lezione abbiamo visto un esperimento che prevede la somministrazione di 2 impulsi:
        
        il primo impulso a 180° che andrà a ribaltare la magnetizzazione; successivamente si aspetterà un determinato tempo di evoluzione1 τ1, nel quale il vettore magnetizzazione tenderà a ruotare verso il campo B0 (mettiamo il vettore abbia ora angolo 170°); a questo punto si somministra un secondo impulso a 90°, che virtualmente fa muovere il vettore magnetizzazione in modo da tagliare il campo BO in basso (fino a 260°).
        In seguito, si misura la corrente generata sull’asse, che sarà proporzionale alla componente proiettata sull’asse stesso. Questo primo punto viene posto su un grafico ed avrà un valore negativo. A questo punto si fa rilassare completamente il sistema: si aspetta e si ripete l’esperimento con un nuovo tempo di evoluzione maggiore τ2 (che porta il vettore a 160°). Si riporta il secondo punto su grafico e, una volta ripetuto l’esperimento diverse volte, si ottengono diversi punti che comporranno la cosiddetta curva di rilassamento, di andamento esponenziale.
        
        TEMPO DI RILASSAMENTO T2 (SPIN-SPIN) si esplicita nella perdita di fase del vettore magnetizzazione.
        
        Dopo un generico impulso a 90 gradi il vettore magnetizzazione si orienta parallelo al piano xy. Quando il vettore magnetizzazione è in questa posizione i nuclei tenderanno a ruotare con medesima frequenza di Larmor. Una volta cessato l’impulso, durante il processo di rilassamento, la magnetizzazione netta subisce una perdita della coerenza di fase: i diversi nuclei processano attorno al campo magnetico con diverse frequenze di Larmor, questo perché i diversi nuclei hanno intorni chimici differenti
        
        A lezione abbiamo visto un esperimento che prevede la somministrazione di due impulsi: questa volta un primo impulso a 90°, che porta l’interno sistema alla coerenza di fase.
        Dopo l'impulso a 90° infatti, la magnetizzazione viene ruotata nel piano xy, e gli spin dei nuclei iniziano a precessare attorno all'asse z con la stessa frequenza di Larmor (frequenza di precessione). Il primo impulso a 90° quindi, porta alla “chiusura del ventaglio”, che tende poi ad essere riaperto. Mentre si ha la riapertura del ventaglio, i vettori di magnetizzazione tendono a riallinearsi a B0 e le precessioni tornano ad avere valori differenti tra i nuclei. Anche in questo caso si aspetta un tempo di evoluzione τ1 e si da un secondo impulso a 180° che ribalterà il vettore magnetizzazione come anche il ventaglio
        
        A questo punto si accende il ricevitore: il sistema tendera (come vediamo in figura), prima a chiudere il ventaglio (quindi il segnale aumenta), poi a ritornare sull’asse z.
        Come vediamo in figura infatti, i segnali di echo sono delle curve che salgono fino ad un massimo e poi riscendono. All’aumentare del tempo di evoluzione aumenta l’ambiezza del segnale di echo.
        
        Da questi segnali si può ricostruire la curva di rilassamento, semplice da rappresentare. Si tratta di una curva esponenziale decrescente, la cui equazione è la seguente: M(τ) = M0 exp(-τ/T2), dove T2 è il tempo di rilassamento spin-spin che è il tempo necessario affinché i nuclei perdano il 63% della coerenza di fase una volta cessato l’impulso a 90°.
        
        In questo esperimento, si parte dall'applicare un impulso magnetico a 90°. Questo impulso provoca la rotazione della magnetizzazione nel piano xy, in modo che gli spin dei nuclei inizino a precessare attorno all'asse z con la stessa frequenza di Larmor, che dipende dalla forza del campo magnetico applicato.
        Quando il ventaglio si chiude, significa che i vettori di magnetizzazione tendono ad allinearsi con il campo magnetico esterno B0.
        Successivamente, dopo un certo tempo di evoluzione τ1, viene applicato un secondo impulso magnetico a 180°, che ribalta la magnetizzazione, riaprendo il ventaglio.
        Quando si accende il ricevitore, si osserva un segnale di echo.
        Questo segnale è una misura della magnetizzazione residua nel sistema.
        Inizialmente, il segnale di echo aumenta perché il ventaglio si chiude e la magnetizzazione si allinea con B0, amplificando il segnale rilevato.
        Successivamente, il segnale diminuisce quando il ventaglio si riapre e la magnetizzazione inizia a ritornare verso l'asse z.
        Aumentando il tempo di evoluzione τ1, si permette ai nuclei di interagire maggiormente con il loro ambiente circostante, il che può portare a una maggiore dispersione dei segnali e, di conseguenza, ad un aumento dell'ampiezza del segnale di echo.
      - 4- Rivelazione e analisi del segnale NMR:
        I segnali radiofrequenza emessi durante il rilassamento dei nuclei vengono rilevati e registrati da un ricevitore. Questi segnali sono poi elaborati per generare uno spettro NMR.
      - La calibrazione consiste nel ripetere l’esperimento dando una durata dell’impulso sempre diversa e lasciando tra un esperimento ed il successivo abbastanza tempo affinché il sistema si rilassi completamente.
        Se non si aspetta che il sistema rilassi completamente, ovvero si riallinei all’asse B0, si dà l’impulso ad un sistema che non riparte dalla direzione perpendicolare. Se così accadesse, la misura che si otterrebbe sarebbe sistematicamente scorretta.
    - - la CPMG
        
        La tecnica CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill) è una tecnica avanzata utilizzata nella risonanza magnetica nucleare (NMR) la CPMG consente di ottenere una migliore risoluzione temporale e spaziale.
        Nella tecnica CPMG, viene generata una sequenza continua di impulsi magnetici, senza lasciare che il sistema rilassi completamente tra un impulso e l'altro.
        Questo significa che la magnetizzazione viene continuamente ribaltata senza ritornare al punto di partenza. Questo approccio consente di risparmiare tempo sperimentale e di ottenere una rifocalizzazione continua del segnale di echo.
        Per quanto riguarda la lettura del segnale, generalmente si leggono i segnali da entrambi i lati del cerchio descritto nella pagina precedente. In questo caso, la sequenza di impulsi sarebbe la seguente: tempo di evoluzione, impulso a 180°, ricevimento del segnale, parziale chiusura del ventaglio, impulso a 180°, parziale riapertura del ventaglio, e così via. Questo permette di ottenere segnali sia a sinistra che a destra del cerchio.
        
        Un grande vantaggio della tecnica CPMG è la sua capacità di ottenere segnali a distanza ravvicinata l'uno dall'altro. Questo consente di catturare immagini con una risoluzione temporale elevata, riducendo al minimo gli spostamenti molecolari durante l'acquisizione dei dati.
        Quando si analizza un campione eterogeneo, è possibile misurare più tempi di rilassamento, uno per ogni voxel (una sorta di pixel tridimensionale).
        Questi contributi diversi al rilassamento vengono analizzati e misurati tramite una singola curva di rilassamento.
        Per fare ciò, si utilizza un modello di fitting multiesponenziale, che somma più componenti esponenziali diverse, ognuna relativa a un diverso voxel.
        
        L'equazione utilizzata per il fitting è la seguente: M = M0’ exp(-τ/T2’) + M0’’ exp(-τ/T2’’), come somma di due componenti dove M è il segnale misurato, M0' eM0'' sono le ampiezze delle due componenti, T2′ e T2''sono i tempi di rilassamento corrispondenti, e τ τ è il tempo di evoluzione. Questa equazione tiene conto dei contributi distinti al rilassamento provenienti dai diversi voxel nel campione.
      - RISONANZA MAGNETICA AD IMPULSO
        
        Per introdurre l’nmr ad impulso bisogna introdurre il convertitore analogico digitale: si tratta di uno strumento che converte un segnale analogico (una corrente, per esempio) in un numero.
        Un segnale analogico è continuo (una linea per intenderci); quando andiamo a digitalizzarlo dobbiamo scegliere ogni quanto registrare l’informazione e trasformarla in un numero (la linea diventa una scala). Chiaramente digitalizzando con più dettaglio avremo una maggiore risoluzione.
        
        Il componente elettrico per trasformare l’informazione analogica in digitale è il condensatore:
        i condensatori accumulano energia e vengono posti in serie: quando il condensatore è carico, il computer registra 1 bit, l’unità di misura fondamentale nella digitalizzazione.
        Avremo quindi una tabella in cui ad ogni tempo caratteristico è associato un numero specifico di bit. (in figura al condensatore è associato un cilindro graduato, 5 tacche del cilindro corrispondono a 5 condensatori in serie caricati).
        L’incertezza è 1\dt Hz.
        Maggiore è l’intervallo tra un “campionamento” l’altro maggiore sarà l’incertezza.
        
        La durata dell’impulso mi dà l’ampiezza: infatti al tempo dell’impulso è correlata l’intensità di corrente.
        Maggiore sarà la durata dell’impulso, maggiore sarà l’intensità registrata dal ricevitore, come anche l’ampiezza dell’onda (distanza tra lo zero il punto massimo in y).
        L’Hz è cicli per secondo, se noi vogliamo N Hz il segnale andrà campionato ogni 1\2 N secondi. Se usiamo una velocità di 10 microsecondi possiamo ottenere una frequenza di 50 kHz.
        
        La velocità di acquisizione invece mi permette di definire fino a che frequenza posso acquisire. Se acquisisco informazioni molto rapidamente riesco a registrare frequenze molto alte (le prime a sinistra nel grafico a sinistra)
        Infine, la durata dell’acquisizione stessa determina la minima frequenza registrabile: più lunga sarà la durata dell’esperimento meglio visualizzerò i sistemi che risuonano a lunghezze d’onda maggiori.
        
        Nel secondo grafico è stata applicata la trasformata di Fourier per ottenere un grafico sul quali abbiamo le diverse frequenze sulle ascisse e la concentrazione dei sistemi che risuonano a quella specifica frequenza sulle ordinate. (frequenze più alte sono destra). La trasformata di Fourier mi permette quindi di discriminare le diverse onde che compongono un’onda complessa.
        Ogni onda discriminata sarà relativa ad un idrogeno con un intorno chimico diverso.
        Nel caso precedente abbiamo 4 picchi diversi: ognuno relativo ad un intorno chimico specifico il convertitore analogico digitale (ADC) (che applica la trasformata di Fourier) mi permette inoltre di sottrarre la componente delle onde elettromagnetiche del segnale fornito al sistema rispetto alla componente del segnale emesso dal sistema stesso.
      - LA CALIBRAZIONE
        
        TRIMETIL SILANO
        
        TMS è utilizzato come standard di riferimento interno nella spettroscopia NMR per calibrare gli spettri, fornendo un riferimento universale e facilitando il confronto tra spettri acquisiti in diverse condizioni sperimentali.
        
        Il tetrametilsilano ha simmetria tetraedrica nel quale il silicio lega quattro gruppi metili tramite legami singoli.
        I 3 protoni di ogni metile risuonano alla stessa frequenza poiché sono liberi di ruotare , ma dato che il silicio ha anche lui una simmetria tetraedrica e i metili sono liberi di ruotare, le condizioni di ogni idrogeno della molecola sono le stesse e alla fine si avrà un’unica banda intensa, che però è spostata a frequenze più alte.
        Il vantaggio nell’utilizzo del TMS sta ne fatto che è rilevabile anche a basse concentrazioni ed è molto poco reattivo (il segnale derivante dal TMS non si sovrappone mai con quello di altre molecole); avendo inoltre un basso punto di ebollizione può essere aggiunto al campione per calibrare lo strumento per poi essere rimosso.
        
        Il "picco di riferimento" del TMS è assegnato arbitrariamente un valore di 0 ppm (parti per milione) di chemical shift.
        La scala dei ppm, anche chiamata scalda delta, viene generata misurando la differenza tra la frequenza di risonanza del picco del TMS e la frequenza di risonanza di altre molecole nello spettro.
        Questo consente di assegnare valori specifici di ppm a ciascun picco dello spettro
        
        Il "picco di riferimento" del TMS è assegnato arbitrariamente un valore di 0 ppm (parti per milione) di chemical shift. La scala dei ppm, anche chiamata scalda delta, viene generata misurando la differenza tra la frequenza di risonanza del picco del TMS e la frequenza di risonanza di altre molecole nello spettro. Questo consente di assegnare valori specifici di ppm a ciascun picco dello spettro
        
        requenza di risonanza (ν₀):
        La frequenza di risonanza di un nucleo dipende dal campo magnetico esterno (B₀) e dalla costante di schermo (σ) del nucleo stesso.
        La formula per calcolare la frequenza di risonanza è:
        ν0=γ/2π per B0(1-σ)
        dove:
        ν 0 è la frequenza di risonanza del nucleo.
        γ è il rapporto giromagnetico del nucleo.
        B 0 è il campo magnetico esterno.
        σ è la costante di schermo del nucleo, che riflette l'effetto della schermatura o deschermatura e varia a seconda dell'ambiente chimico del nucleo.
        
        SCALA DELTA
        Per eliminare la dipendenza dalla frequenza del campo magnetico esterno e semplificare le misurazioni, viene utilizzata la scala delta.
        Questa scala si ottiene sottraendo la frequenza del segnale del composto in esame dalla frequenza del segnale del tetrametilsilano (TMS), un composto comune usato come standard di riferimento nella RMN, e dividendo per la frequenza del TMS (moltiplicata per un milione).
        La formula è δ=(νcomp−νTMS)νTMS×106
        dove:
        δ è la posizione del segnale sulla scala delta.
        vcomp è la frequenza di risonanza del composto in esame.
        νTMS è la frequenza di risonanza del TMS.
        
        Significato della scala delta:
        Utilizzando la scala delta, la posizione della banda nello spettro RMN è sempre la stessa indipendentemente dal campo magnetico applicato.
        Questo perché la distanza tra la frequenza del segnale del TMS e quella del composto in esame è normalizzata. Senza la scala delta, dovremmo descrivere la posizione della banda in hertz e specificare il campo magnetico applicato ogni volta.
        
        la scala delta semplifica le misurazioni e consente una comparabilità universale dei dati RMN, eliminando la dipendenza dal campo magnetico esterno.
        
        RISOLUZIONE SPETTRALE RMN
        
        Dipendenza della frequenza dal campo magnetico: In RMN, la frequenza di risonanza di un nucleo è direttamente proporzionale al campo magnetico applicato. Quindi, se raddoppi il campo magnetico da 300 MHz a 600 MHz, la frequenza del segnale dello stesso campione raddoppierà anche, passando da 300 MHz a 600 MHz.
        
        Scala delta costante:
        La scala delta, che è espressa in parti per milione (ppm o δ), è una misura relativa della posizione dei picchi nello spettro RMN.
        Quando diciamo che la finestra spettrale è sempre 10 ppm, significa che la scala delta rimane costante, indipendentemente dal campo magnetico applicato. Quindi, anche se la frequenza assoluta dei segnali cambia con il campo magnetico, la posizione relativa dei picchi rimane la stessa.
        
        influenza sulla risoluzione spettrale:
        La risoluzione spettrale è la capacità di distinguere tra picchi vicini nello spettro RMN. Aumentare il campo magnetico ha un impatto sulla risoluzione perché l'ampiezza dei picchi dipende dalla differenza di frequenza tra di essi.
        Quando aumenti il campo magnetico, la differenza di frequenza tra picchi simili si amplifica, rendendo più facile distinguere tra di essi. Questo è perché, sebbene la scala delta rimanga costante, la distanza in hertz tra i picchi aumenta con il campo magnetico
        
        spettro più risolto:
        Quando aumenti il campo magnetico, la finestra spettrale rimane costante in scala delta ma si allarga in termini assoluti in hertz.
        Questo significa che la stessa scala delta coprirà una gamma più ampia di frequenze assolute. Di conseguenza, lo spettro apparirà più risolto perché ci saranno meno sovrapposizioni tra i picchi e sarà più facile distinguere tra di essi.
        
        la struttura dei segnali nello spettro di risonanza magnetica nucleare (RMN),
        
        che possono apparire come doppietti, triplette o quartetti anziché come singoli picchi.
        
        Struttura delle bande:
        Nel contesto della RMN, i segnali non appaiono sempre come semplici picchi a forma di campana (lorenziane singole), ma possono essere composti da più picchi. Questa composizione è dovuta all'interazione tra i nuclei vicini e alla loro influenza reciproca sui livelli energetici dei sistemi di spin.
        
        2 more items...
    - - CHEMICAL SHIFT
        
        Fornisce informazioni sull'intorno chimico di del protone che si sta studiando (N.B. nell'1H-NMR, sono i protoniche generano le risonanze).
        Ovunque ci sia un idrogeno, tramite risonanza possiamo avere informazioni riguardo il suo intorno chimico.
        • Dove si trova il picco :green_cross:
        
        a SX del picco - Down-field = vicino ad elementi elettronegativi
        
        a DX del picco - Up-field = lontano da elementi elettronegativi
        Caso: -protone vicino ad un atomo elettronegativo:
        «deshielding effect» = Down-field
      - INTEGRATION
        Chemically equivalent protons (=Sullo stesso carbonio, «vedono» la stessa porzione della molecola) Esempio: 3 protoni sullo stesso gruppo metile. Informazione: quanti protoni chimicamente equivalenti stanno generando quella risonanza e, di conseguenza, quel picco. - innalzamento
      - SPLITTING
        La risonanza viene divisa in un certo numero di picchi più piccoli in funzione dei protoni vicini (=su altri carboni). n+1 rule: «n» è il numero di protoni vicini.
      - spiegazione prof
        
        Nell’analizzare gli spettri si deve sempre considerare che un campo magnetico esterno genera su delle cariche indotte (in questo caso gli elettroni) un nuovo campo magnetico indotto. l’effetto si chiama anisotropia diamagnetica.
        Per sottolineare la direzionalità del fenomeno e come questo sia collegato al moto degli elettroni abbiamo fatto 3 esempi: in ogni esempio di deve considerare come venga generata una corrente elettronica: si utilizza la regola della mano destra. Si utilizzera nuovamente la regola della mano destra per capire in che direzione si applichera il nuovo campo magnetico indotto.
        
        In sostanza, quando un campo magnetico esterno viene applicato a una molecola, gli elettroni all'interno della molecola reagiscono generando un campo magnetico indotto, che può essere orientato in modo diverso a seconda della struttura elettronica della molecola stessa. Questo fenomeno è noto come anisotropia diamagnetica.
        
        Per comprendere la direzione del campo magnetico indotto, possiamo utilizzare la regola della mano destra. Se l'orbitale elettronico è rotante attorno a un legame, il campo magnetico indotto sarà opposto al campo esterno (e quindi schermerà gli atomi di idrogeno). Questo è il caso, ad esempio, dell'acetilene.
        
        L'acetilene è una molecola costituita da due atomi di carbonio collegati da un triplo legame e da due atomi di idrogeno, uno legato ad ogni atomo di carbonio. Nell'acetilene, gli elettroni all'interno del triplo legame ruotano intorno ad esso.
        
        Quando viene applicato un campo magnetico esterno alla molecola di acetilene, gli elettroni all'interno del triplo legame reagiscono generando un campo magnetico indotto.
        Questo campo magnetico indotto sarà opposto al campo magnetico esterno. Utilizzando la regola della mano destra, possiamo immaginare che il campo magnetico indotto punta in una direzione opposta rispetto al campo magnetico esterno.
        Di conseguenza, gli atomi di idrogeno legati agli atomi di carbonio risentono di un campo magnetico indotto che li scherma, o protegge, dal campo magnetico esterno. Questo significa che gli idrogeni sembreranno essere meno sensibili al campo magnetico esterno rispetto a quanto sarebbero senza il campo magnetico indotto.
        In termini di spettro NMR, ciò si traduce in un "chemical shift" verso destra nello spettro, il che significa che le frequenze più alte saranno registrate a sinistra nello spettro.
        
        acetaldeide
        
        Quando un campo magnetico esterno viene applicato alla molecola di acetaldeide, gli elettroni all'interno del doppio legame reagiscono generando un campo magnetico indotto. Utilizzando la regola della mano destra, possiamo immaginare che il campo magnetico indotto sia orientato in una direzione opposta rispetto al campo magnetico esterno. Di conseguenza, gli atomi di idrogeno legati agli atomi di carbonio risentono di un campo magnetico indotto che li scherma, o protegge, dal campo magnetico esterno.
        Questo significa che gli idrogeni sembreranno essere meno sensibili al campo magnetico esterno rispetto a quanto sarebbero senza il campo magnetico indotto.
        
        poiché il doppio legame in acetaldeide è lungo l'asse della molecola, il campo magnetico indotto sull'asse della molecola sarà opposto al campo magnetico esterno. Tuttavia, gli idrogeni legati al carbonio esterno, dove il campo magnetico ruota per rientrare sull'asse della molecola, risentiranno di un campo nella stessa direzione del campo magnetico esterno. Ciò significa che questi idrogeni saranno meno schermati rispetto a quelli legati al carbonio interno. Questo fenomeno è noto come deschermatura degli idrogeni.
        ciò si traduce in un "chemical shift" verso sinistra nello spettro, il che significa che le frequenze più basse saranno registrate a sinistra nello spettro.
        Quindi, nell'acetaldeide, gli idrogeni sono deschermati e si osserva un "chemical shift" verso sinistra nello spettro NMR.
        
        e molecole con anelli aromatici, come il benzene, dove gli elettroni sono distribuiti sul piano della molecola, il campo magnetico indotto sarà ancora una volta opposto al campo esterno, ma gli idrogeni all'esterno dell'anello risentiranno di un campo nella stessa direzione del campo esterno. Questo porta nuovamente a una deschermatura degli idrogeni.
        
        n termini di spettro NMR, quando gli elettroni sono schermati, il campo magnetico indotto riduce l'intensità del segnale finale, causando un "chemical shift" verso destra nello spettro (frequenze più alte a sinistra). Al contrario, quando gli elettroni sono deschermati, il campo magnetico indotto aumenta l'intensità del segnale finale, causando un "chemical shift" verso sinistra nello spettro.
        In generale, le molecole con legami singoli possono generare un campo magnetico indotto, ma il loro contributo al campo magnetico complessivo è di solito trascurabile rispetto a quello delle molecole con legami doppi o tripli, che hanno una maggiore densità elettronica e quindi un effetto maggiore sull'anisotropia diamagnetica.
        
        Sullo spettro possiamo assegnare i segnali, andando da segnali attribuiti a gruppi insaturi (con legami singoli) a sinistra a gruppi sempre più saturi (con maggiori doppi legami o tripli) a destra.
        
        Altri fattori influenzano il chemical shift: Il ripiegamento della molecola e l’impedimento sterico giocano un ruolo importante nel determinare la posizione della banda nello spettro. Bisogna considerare anche i movimenti dinamici della molecola .
        
        L'equilibrio cheto-enolico è un fenomeno che si verifica in alcune molecole organiche contenenti gruppi funzionali come il carbonile (C=O) e l'idrossile (OH).
        In queste molecole, il gruppo carbonilico può esistere in due forme strutturali diverse: la forma chetonica, in cui il carbonio è legato a due atomi di carbonio, e la forma enolica, in cui il carbonio è legato a un atomo di carbonio e a un atomo di ossigeno tramite un legame doppio.
        
        Durante l'equilibrio cheto-enolico, la molecola può interconvertirsi tra la forma chetonica e la forma enolica. Questo significa che, in una soluzione contenente la molecola, ci saranno molecole che esistono in entrambe le forme strutturali. Tuttavia, la proporzione di molecole in ciascuna forma dipenderà dalle condizioni specifiche, come temperatura e solvente.
        
        Quando viene eseguita la spettroscopia NMR su una soluzione contenente molecole in equilibrio cheto-enolico, gli spettri NMR mostreranno segnali corrispondenti a entrambe le forme strutturali.
        Questi segnali saranno distinti e caratterizzati da un "chemical shift" differente, poiché le due forme hanno ambienti chimici diversi. In pratica, è come se avessimo la sovrapposizione di due insiemi di informazioni nello spettro NMR: uno proveniente dalla forma chetonica e l'altro dalla forma enolica. Poiché i due gruppi funzionali hanno ambienti chimici diversi, i segnali corrispondenti avranno "chemical shift" diversi.
        All'interno del campione reale, è possibile trovare diverse situazioni.
        In alcuni casi, le molecole possono esistere principalmente in una delle due forme e quindi i segnali NMR saranno dominati da quella forma. In altri casi, le molecole possono interconvertirsi rapidamente tra le due forme, producendo segnali NMR che riflettono l'equilibrio tra le due forme.
        
        La tecnica RMN è inoltre molto utilizzata nello studio di funzione/attività degli enzimi perché permette di identificare quali sono i gruppi coinvolti nell’interazione tra molecole.
        Ad esempio nell’interazione tra una piccola molecola che inibisce il funzionamento di un enzima possiamo identificare il gruppo funzionale responsabile dell’interazione andando a vedere come cambia il chemical shift di alcuni gruppi dell’enzima quando sono in interazione con la molecola che ne inibisce il funzionamento. In questo caso non andrebbe solo a cambiare la posizione della banda relativo al gruppo funzionale responsabile del legame, ma andrebbe a modificarsi anche la larghezza di altre bande, perché cambiano i tempi di rilassamento dell’intero sistema.
        
        In foto vediamo segnale piccolo e largo. Piccolo perché è dovuto all’OH della specie enolica che avrà un’intensità che dipende dalla concentrazione (in questo caso bassa) e dal rapporto tra forma enolica e chetonica.
        La larghezza, invece, dipende dallo scambio chimico che quel protone subisce. Questo è un aspetto dinamico. Lo scambio chimico consiste nel passaggio del protone dal solvente alla molecola e viceversa. Gli idrogeni tendono a fare legami idrogeno con altri ossigeni in soluzione e quindi il segnale si allarga